一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用，以静电纺纳米纤维膜为肠道细胞的载体材料，将分离的肠道细胞接种到该载体材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。本发明专利技术基于静电纺纳米纤维膜与天然细胞外基质相似的三维结构，实现对天然细胞外基质结构的仿生模拟，大幅提升原代肠道细胞在载体材料表面黏附和生长的性能。所构建的模型具有模仿真实肠道的能力，可以广泛用于营养物质和药物组分的吸收和转运分析，快捷、准确地评估营养物质和药物的吸收能力和生物利用度，也可用于评估肠道微生物定殖或相互作用，有可用于组织工程的使用。

An in vitro intestinal model based on primary intestinal cells and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用。
技术介绍
体外肠道吸收模型被广泛用于药物和营养物质吸收的评估，其吸收性数据被用于早期药物开发和营养物质开发的体外快速分析和筛选。近十余年来，国内外已普遍采用细胞模型作为药物和营养物质等成分的肠道吸收模型。其中Caco-2肠道细胞模型来源于人的结肠癌细胞，是著名的小肠吸收模型，已被发达国家的药物研究机构或开发公司广泛采用，是目前最为经典的一种体外肠道模型。作为一种附着依赖型细胞，Caco-2细胞最常见的培养模型是单层贴壁培养模型。Caco-2细胞一般培养在具有渗透性的多孔高分子膜上，并制作成插入式滤膜(permeableinsert)的形式，如商业化的Transwell@、Millicell@等产品。其高分子膜材料通常使用半透明的聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)，或透明的聚酯(Polyester，PET)和聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)等膜材料。在这类膜材料上，Caco-2肠道细胞至少需要培养21天，才能充分分化并表达出较为接近人体小肠上皮的功能。因此这种培养模型仍需投入大量的人力、物力与时间，同时也增加了细胞在培养过程中受到污染的危险，而且其实验通量仍不够高，导致其应用仍存在一定的限制。而众所周知，Caco-2细胞是来源于人的结肠癌细胞，癌细胞系在培养的过程中，会出现基因突变的加速积累、正常生理反应的丧失以及对组织培养生长的适应能力，使得它们与原代细胞的培养存在显著差异。因此，基于Caco-2细胞建立的体外肠道模型仅具有肠道的小部分生理功能，并不能再现正常的小肠细胞谱系和功能。鉴于此，麻省理工学院的研究者(CN105358677A)将Lgr5+肠道上皮干细胞从肠道中分离并在体外培养形成含有隐窝-绒毛结构的类器官，所述的类器官重现天然小肠上皮(Sato等，2009)。但是，干细胞的分离难度大，分离成本高。更为重要的是，Lgr5+肠道上皮干细胞体外培养获得的是球形的类器官，肠道上皮层分布在所形成的封闭球形类器官的内腔，给后续评估药物和营养物质等在肠道界面吸收、转运、代谢的能力及生物利用度等工作带来了极大的不便，其吸收实验操作需在显微镜下通过微针注射完成，该干细胞形成的类器官并不能很好地模拟肠道界面的吸收。时至今日，以原代细胞或干细胞在体外构建大面积的肠道界面仍然是一个世界难题。因此，急需发展一种培养周期短、且成本低的原代肠道细胞体外模型构建方法，可更真实地模拟肠道界面，在面向医药、营养和组织工程的非临床和临床系统中具有重要作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型及其构建方法和应用，以静电纺纤维膜为原代肠道细胞培养的载体材料，通过表面图案化和化学改性，为肠道细胞提供理想的黏附、铺展和生长的仿生微环境，促进肠道细胞在载体材料表面快速贴壁生长，并形成完整细胞单层，分化出小肠上皮的生理功能，从而具备模拟真实肠道的能力。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的目的之一在于提供一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，以静电纺纳米纤维膜为原代肠道细胞的载体材料，将原代肠道细胞接种到该材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善的生物活性和生理功能的体外肠道模型。作为本专利技术优选的方案，将静电纺纳米纤维膜材料固定到含培养基的腔室中间作为隔层材料，然后将原代肠道细胞接种到该材料表面培养，直至形成完整的肠道细胞层，并获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。作为本专利技术优选的方案，所述的分离的肠道细胞包括从肠道组织中分离的单细胞、细胞团和隐窝。作为本专利技术优选的方案，所述的分离的肠道细胞包括从从小肠和大肠中分离的肠道细胞。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜的材料包括天然聚合物或合成聚合物及其衍生物中的一种或几种，天然聚合物或合成聚合物及其衍生物具体为胶原蛋白、成纤蛋白、角蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸、结冷胶、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚乳酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚苹果酸、聚羟基脂肪酸酯等及其衍生物类，生物相容性较好的材料，做成静电纺纳米纤维膜作为本专利技术载体材料应用时具有较好的效果。更优选的，本专利技术采用静电纺丝所使用的纺丝溶液包括熔融型溶液和溶剂型溶液。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜中的纤维尺寸为静电纺技术可制备的所有尺寸，一般在50nm-5000nm范围内，但不局限于此。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜的厚度，一般在1μm-200μm范围内，但不局限于此。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料可经过表面改性处理，也可不经过表面改性处理。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用蛋白、肽、氨基酸、糖、糖肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、生长因子等天然或合成的单一组分或复合组分对其表面进行化学组分改性处理。其中化学组分改性的方法有共混、浸涂、化学键固定等。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用压印法、模板法等方法对其表面进行改性处理，得到图案化的静电纺纳米纤维膜材料。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜材料采用压印法、模板法等方法制备得到图案化的静电纺纳米纤维膜材料，其图案为直径为50-500μm左右的凸起或凹坑，与肠道上皮的绒毛和隐窝结构类似。作为本专利技术优选的方案，所述静电纺纳米纤维膜使用时可单独使用，也可复合到多孔材料表面，所述多孔材料包括有机和无机的多孔材料。作为本专利技术优选的方案，所述多孔材料为多孔膜、无纺布或金属网中的一种。作为本专利技术优选的方案，所述原代肠道细胞体外肠道模型使用的培养基为AdvancedDMEM/F12培养基，在此基础上添加1％HEPES(1M)、1％Anti-Anti(100X)和1％GlutaMAX，并在每mL培养基中添加50μLR-spondin、5μLEGF、10μLY2763210、10μLN-acetylcysteine、10μLN-2、20μLB27、1μLLDN-193189等细胞因子。本专利技术的目的之二在于提供由所述方法构建的基于原代肠道细胞的体外肠道模型。本专利技术的目的之三在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估药物、营养物质吸收能力或生物利用度中的应用。本专利技术的目的之四在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估肠道微生物定殖或相互作用中的应用。本专利技术的目的之五在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在评估肠道其他生物或生理现象的应用。本专利技术的目的之六在于提供所述基于原代肠道细胞的体外肠道模型在组织工程中的应用，修复受损肠道上皮组织。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，本专利技术主要利用静电纺纳米纤维膜作为原代肠道细胞的载体材料，基于静电纺纳米纤维膜与天然细胞外基质相似的三维结构，实现对天然细胞外基质结构的仿生模拟，大幅提升原代肠道细胞在载体材料表面黏附和生长的性能。本专利技术所构建的模型具有模仿真实肠道的能力，可以广泛用于营养物质和药物组分的吸收和转运分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：以静电纺纳米纤维膜为肠道细胞的载体材料，将分离的肠道细胞接种到该载体材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。

【技术特征摘要】
1.一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：以静电纺纳米纤维膜为肠道细胞的载体材料，将分离的肠道细胞接种到该载体材料表面，培养直至形成完整的肠道细胞层并分化出小肠绒毛，获得具备完善生物活性和生理功能的体外肠道模型。2.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述的分离的肠道细胞为单细胞、细胞团或隐窝中的一种或多种；所述分离的肠道细胞为从小肠或大肠中分离的肠道细胞。3.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜中的纤维尺寸为50nm-5000nm。4.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜表面采用蛋白、肽、氨基酸、糖、糖肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、生长因子中的单一组分或复合组分进行化学组分改性处理。5.根据权利要求1所述的一种基于原代肠道细胞的体外肠道模型的构建方法，其特征在于：所述静电纺纳米纤维膜表面采用压印法、模板法进行改性处理，得到图案...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡梦欣，牛红梅，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33