一种体外血管化组织的构建方法及其用途技术

本发明专利技术提供了一种体外血管化组织的构建方法及其用途，将人类胚胎干细胞在细胞培养条件下分化诱导培养，获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；然后将其在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；将获得的两种细胞以适宜比例接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织；本发明专利技术获得的体外血管化组织相较传统的体外模型更接近生理上的现实，可用于识别参与血管变化的信号通路,并开发药物,以减轻多种疾病中的微血管变化。

【技术实现步骤摘要】
一种体外血管化组织的构建方法及其用途
本专利技术涉及细胞体外培养
，具体而言，涉及一种体外血管化组织的构建方法及其应用。
技术介绍
人类胚胎干细胞(hESCs)是可以自我更新和分化为任何类型细胞系的多能细胞。分化过程中,hESCs获得特殊细胞类型的属性,如心脏(心肌细胞),肝脏(肝细胞),大脑(神经元),皮肤(角质形成细胞)。hESCs最大的治疗希望是产生专门的细胞,以取代各种退行性疾病患者的受损组织。hESCs是了解细胞分化和器官形成所涉及的复杂机制的宝贵工具。此外,hESCs的无限自我更新能力和可塑性允许在体外生成无限数量的不同细胞类型,并为再生医学开辟了新的途径。血管生成是一个改造已建立的原始血管网络的过程。EC迁移和增殖,空腔形成,和EC成熟的功能毛细血管。活化ECs释放各种蛋白酶进入周围地区,使基底膜降解。血管芽从现有的血管成长为间质空间。在萌发过程中,位于血管萌发顶端的ECs在血管内皮生长因子(vegf)等趋化因子的浓度梯度的指导下,延长了长的丝状足。位于血管茎中的ECs在对vegf的反应中增殖。ECs通过胞饮和胞吞形成空泡,这些空泡在毛细血管的长时间延伸中聚集形成腔。通过停止EC的增殖和合成新的基底膜,使毛细血管稳定。血管生成发生在卵黄囊和胚胎发育过程中,以及在后期的器官分化,完全分化的周皮细胞对新形成的毛细血管有许多作用。它们的收缩表型允许EC管收缩和放松,从而调节毛细血管的血液流动。它们还通过基础细胞外基质来稳定新形成的血管。由此产生的多种细胞类型之间的相互作用必须仔细检查,以便通过完整的血管网络再生功能组织。植入性三维血管工程组织可以通过在大孔支架上共同培养内皮细胞和成纤维细胞来构建。体外模型模拟了细胞外基质中最初人类结缔组织系统的特性。这种仿生已被证明对细胞支架相互作用有积极影响,如细胞附着、迁移、增殖和功能。现有体外血管生成模型多采用内皮细胞接种至凝胶上进行培养，该血管生成模型过于简化，存在稳定性差，血管网络成熟慢等缺点。另外现有的细胞培养还需要使用源自动物的蛋白质(血清)，显著影响了细胞体外培养的规模，另外由于异源动物血清成分的加入，增加了病原污染及免疫排斥的几率，妨碍其临床使用并且根据使用的血清批次而影响过程的可再现性。目前的模型即昂贵又受批次差异影响。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术一方面提供了一种体外血管化组织的构建方法，包括如下步骤：1)将人类胚胎干细胞(hESCs)在细胞培养条件下诱导培养，获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；2)将步骤1)获得的纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；以及3)将步骤2)获得的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织。采用人类胚胎干细胞进行增殖培养可获得大量细胞资源，为研究提供了易得且较为廉价的细胞来源；采用分化获得的内皮细胞和血管平滑肌细胞在支架上共培养，提高了体外血管化组织稳定性及生成速度。优选地，所述诱导培养包括采用无异源无血清培养基。无异源无血清培养基可以避免异源血清的加入导致的病原污染及免疫排斥问题，降低批次间的差异。优选地，所述诱导培养包括在CHIR9901分子存在的情况下诱导细胞分化，分化过程中,用BMP4和VEGF进行连续处理。所述支架为包含基于天然或杂化聚合物的支架。进一步优选地，所述支架优选聚乙二醇-纤维蛋白。聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶具有良好的聚合浓度及生化性能，有利于细胞增殖、迁移和血管化组织的形成。优选地，步骤3)中所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。根据另一方面，本专利技术提供一种体外血管化组织，其采用上述方法构建。优选地，所述体外血管化组织维持在细胞培养物中。根据另一方面，本专利技术提供了一种上述体外血管化组织在药物筛选中的应用。优选地，所述药物为抗血管生成和/或促血管生成药物。根据另一方面，本专利技术提供了一种微流体平台，包括载玻片及连接于其上的由5μm孔径多孔膜分隔的上下两层聚二甲基硅氧烷层，上层聚二甲基硅氧烷层中心具有圆形外壳，外壳内容纳体外血管化组织。优选地，下层聚二甲基硅氧烷层具有若干个平行微通道，微通道的出口和入口连接了培养基储存腔。优选地，所述平行微通道高度和宽度均优选为150μm，个数优选为5个。优选地，所述圆形外壳直径优选6mm；所述上下两层聚二甲基硅氧烷层厚度分别优选为2mm和3mm；所述培养基储存腔容量优选为250μl。根据另一方面，本专利技术提供了一种微流体平台的制备方法，包括以下步骤：1)将下层聚二甲基硅氧烷层粘合到载玻片上，制备微通道及培养基存储腔；2)将培养基装入培养基储存腔，在微通道出口侧施加负压,将培养基引入微通道；3)在支架中接种血管内皮细胞和血管平滑肌细胞后转移至上层聚二甲基硅氧烷层外壳内，进行培养，以获得微流体平台。优选地，所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。优选地，培养基每24h更新一次。有益效果：1.本专利技术体外血管化组织生成模型具有快速、易操作、重复性高等优点；采用人类胚胎干细胞增殖培养，提供了易得且较为廉价的细胞来源；采用分化获得的内皮细胞和血管平滑肌细胞以适宜比例在支架上共培养，相较只接种内皮细胞或内皮细胞与其他细胞的组合，提高了体外血管化组织密度、稳定性及生成速度。2.本专利技术采用无异源无血清培养基，避免异源血清的加入导致的病原污染及免疫排斥问题，降低批次间的差异。3.本专利技术采用聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶作为支架，该支架良好的聚合浓度及生化性能，有利于细胞增殖、迁移和血管化组织的形成。4.本专利技术体外血管化组织中的细胞保持其表型、活力、增殖和适当的屏障功能，相较现有体外血管化组织更接近生理上的现实，成本更低，为生物物理和生化特性如何影响血管生物学和病理生理学提供了有价值的定量见解,并作为体内动物研究的补充。5.本专利技术血管化组织和微流体平台可用于识别参与血管变化的信号通路,并开发药物,以减轻多种疾病中的微血管变化。附图说明图1为从hESC分化细胞建立血管化组织的工艺流程图，(A)hESCs；(B)血管平滑肌细胞；(C)血管内皮细胞；(D)3D共培养建立；(E)功能性血管；(F)微流体平台；图2为hESC分化细胞的相差图像，(A)内皮细胞&(C)血管平滑肌细胞；(B)表达VE-钙粘附分子的内皮细胞和(D)vSMC表达α-sma的免疫荧光染色图像；图3为MTF试验:在基质胶和血管样网络交界处的半三维环境中培养了hESC分化的内皮细胞；(A)相差图像和(B)钙-AM染色细胞；标尺:100μm；图4为在聚乙二醇纤维蛋白凝胶中共培养hESC分化的ECs和vSMCs，聚乙二醇化水凝胶支架血管第2天、第5天、第8天及第12天生长图；图5为组织培养板的概览图像,以突出覆盖组织板生长区域的微血管结构的程度；标尺:100μm；图6为三维血管化组织床的共聚焦成像图像,(A)显示由hESC-EC和hESC-vSMCs发展的血管网络；(B)将单个微血管分开并进一步分支,产生两个毛细血管。(C)突出血管中的腔形成；(D)在聚乙二醇纤维蛋白水凝胶中培养的体外血管化床的H&E染色；深色虚线表示vSMC的存在,浅色虚线显示了来自hES本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外血管化组织的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将人类胚胎干细胞在细胞培养条件下分化诱导培养，分选获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；2)将步骤1)获得的纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；以及3)将步骤2)获得的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织。

【技术特征摘要】
1.一种体外血管化组织的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将人类胚胎干细胞在细胞培养条件下分化诱导培养，分选获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；2)将步骤1)获得的纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；以及3)将步骤2)获得的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化诱导培养包括采用无异源无血清培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化诱导培养包括在CHIR9901分子存在的情况下诱导细胞分化，分化过程中,用骨形态发生蛋白4和血管内皮细胞生长因子进行连续处理。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架为包含基于天然或杂化聚合物的支架。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述支架优选聚乙二醇-纤维蛋白。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。7.一种体外血管化组织，其特征在于，采用上述任一项权利要求所述方法构建获得。8.如权利要求7所述体外血管化组织，其特征在于，所述体外血管化组织维持在细胞培养物中。9.一种如权利要求7-8任一项所述的体外...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲厚，哈里什·基兰·汉德尔，韦俊，吴立前，维克拉姆·帕尔德，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33