一种糖缀合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种糖缀合物，和将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基并与载体蛋白赖氨酸的伯氨基反应制备糖缀合物的具体制备方法及一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物。本发明专利技术还公开了所述糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。本发明专利技术所述的糖缀合物具有免疫原性更高、杀菌作用更强的特点。

A Glycoconjugate and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种糖缀合物及其用途
本专利技术涉及疫苗研制
，具体涉及一种肺炎链球菌4型荚膜多糖与载体蛋白反应制备获得的糖缀合物，一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物，以及所述的糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。
技术介绍
肺炎链球菌为革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，宽端相对，尖端相背，有较厚的荚膜。肺炎链球菌感染致病在世界范围内是导致发病率和死亡率的主要因素之一。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎链球菌疾病的最常见表现，而细菌在呼吸道内散播可导致中耳感染、鼻窦炎或者复发型支气管炎。肺炎链球菌细胞壁外的荚膜多糖成分与结构常常与细菌的病原性和血清型有关，目前发现的肺炎链球菌荚膜多糖的变化具有超过90多种不同的血清型，其中，20多种用于制备由肺炎链球菌感染所导致疾病的疫苗。肺炎链球菌缀合物疫苗(PCV)是用于预防肺炎链球菌所致疾病的肺炎球菌疫苗，目前在全球上可以获得十三价疫苗尽管荚膜多糖自身是免疫原性的，但多糖与载体蛋白的缀合已用于改善免疫原性，使用与蛋白载体连接的多糖制备多糖蛋白缀合物疫苗，多糖与蛋白载体的化学键可诱导针对在其表面上展现疫苗所包含的多糖的细菌的免疫应答，由此预防疾病，因此，使用来自致病细菌的多糖的疫苗接种是增强宿主免疫力的潜在策略。例如：非专利文献DecipheringAntigenicDeterminantsofStreptococcuspneumoniaSerotype4CapsularPolysaccharideusingSyntheticOligosaccharides(ACSChem.Biol.，2016，11(2)，pp335–344)公开了丙酮酸基是肺炎链球菌血清型4荚膜多糖的保守抗原位点。同时，专利CN101180079A公开了疫苗的制备方法，包括肺炎链球菌血清型4多糖经过弱酸水解，脱除部分丙酮酸保护基，后经高碘酸钠氧化得到临位醛基，再与蛋白缀合，得到多糖蛋白缀合物。该方法制备的疫苗在免疫应答和功能活性上均取得了很好的效果，但是高碘酸钠氧化糖链的方法必须要求糖链中具有2个相邻的游离羟基基团，同时，荚膜多糖的免疫原性、产率、杀菌作用等依然有提高的空间。专利CN108524931A公开了活化荚膜多糖并与载体蛋白反应制备糖缀合物，具体的，所述的荚膜多糖为肺炎链球菌(S.pneumoniae)(Pn)-血清型3、10A、12F和33F荚膜多糖，并对该糖缀合物的稳定性、免疫原性程度进行验证。但是该专利只是泛泛的提到了在免疫原性组合物中还可以包括通过肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F荚膜多糖制备的糖缀合物，并没有公开肺炎链球菌血清型4荚膜多糖与蛋白载体偶联的糖缀合物，更没有披露血清型4荚膜多糖活化时的氧化位点。
技术实现思路
基于上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种具有多个活性部位的肺炎链球菌血清型4荚膜多糖与蛋白载体偶联的糖缀合物，并且公开了肺炎链球菌血清型4荚膜多糖活化的氧化位点，所述的氧化位点包括乙酰氨基吡喃型甘露糖基(β-D-ManpNAc)、乙酰氨基吡喃型半乳糖基(α-D-GalpNAc)和/或吡喃型半乳糖基(α-D-Galp)。本专利技术还提供了一种糖缀合物的制备方法，该方法适用于任何包含伯羟基的多糖，这是优于高碘酸盐氧化方法的明显优点，高碘酸钠氧化方法需要在糖链中具有两个相邻的(即邻位的)游离羟基(-OH)基团，而本专利技术采用的氧化方法只要求荚膜多糖含有伯羟基。本专利技术进一步提供了一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物。本专利技术还提供了所述糖缀合物、所述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。本专利技术所述的糖缀合物与现有技术中用高碘酸盐氧化后连接蛋白载体的缀合物相比，免疫原性更高，杀菌作用也显著增强。具体地，本专利技术的第一方面，提供了一种糖缀合物，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基与载体蛋白的赖氨酸伯氨基反应制备获得，其中，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌4型荚膜多糖，肺炎链球菌4型荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基的氧化位点包括β-D-ManpNAc、α-D-GalpNAc和/或α-D-Galp。优选的，所述的肺炎链球菌4型荚膜多糖可以为天然的或人工合成的。优选的，所述的载体蛋白含有一个或多个伯氨基。所述的载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。进一步优选的，所述的载体蛋白选自CRM197、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白(HiD)、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1：1方式形成的融合蛋白、百日咳毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的载体蛋白为CRM197。优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3。进一步优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8至1.7。在本专利技术的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为1.0至1.4。在本专利技术的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8-1.2。在本专利技术的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8-1.0。优选的，所述的细菌荚膜多糖的每10至50个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。本专利技术的第二方面，提供了一种糖缀合物的制备方法，包括：以硝酰基化合物和氧化剂作为活化剂将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基；将含有醛基的细菌荚膜多糖与载体蛋白的赖氨酸伯氨基反应制备获得糖缀合物；其中，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌4型荚膜多糖，肺炎链球菌4型荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基的氧化位点包括β-D-ManpNAc、α-D-GalpNAc和/或α-D-Galp。优选的，所述的硝酰基化合物与荚膜多糖的摩尔比＝(0.02～0.1)：1。进一步优选的，所述的硝酰基化合物与荚膜多糖的摩尔比＝(0.06～0.08):1。优选的，所述的氧化剂与荚膜多糖的摩尔比＝(0.1～5)：1。进一步优选的，所述的氧化剂与荚膜多糖的摩尔比＝(1.8～2.5)：1。优选的，未反应的醛基在与载体蛋白缀合之后使用硼氢化钠在封闭反应中还原为伯醇，由此使在涉及氧化及随后的缀合的修饰步骤中，糖表位修饰程度为最小化。优选的，所述的硝酰基化合物为具有所述氧化剂的存在下选择性氧化伯羟基以产生醛基的能力。优选的，所述的氧化剂为具有硝酰基化合物的存在下选择性氧化伯羟基以产生醛基的能力的带有N卤代的氧化剂。优选的，所述的载体蛋白含有一个或多个伯氨基。所述的载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。进一步优选的，所述的载体蛋白选自CRM197、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白(HiD)、由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖缀合物，其特征在于，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基与载体蛋白的赖氨酸伯氨基反应制备获得，其中，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌4型荚膜多糖，肺炎链球菌4型荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基的氧化位点包括β‑D‑ManpNAc、α‑D‑GalpNAc和/或α‑D‑Galp。

【技术特征摘要】
1.一种糖缀合物，其特征在于，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基与载体蛋白的赖氨酸伯氨基反应制备获得，其中，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌4型荚膜多糖，肺炎链球菌4型荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基的氧化位点包括β-D-ManpNAc、α-D-GalpNAc和/或α-D-Galp。2.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的载体蛋白选自CRM197、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白(HiD)、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1：1方式形成的融合蛋白、百日咳毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。3.根据权利要求1或2所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3。4.根据权利要求1-3任一所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖的每10至50个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。5.一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，包括：以硝酰基化合物和氧化剂作为活化剂将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基；将含有醛基的细菌荚膜多糖与载体蛋白的赖氨酸伯氨基反应制备获得糖缀合物；其中，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌4型荚膜多糖，肺炎链球菌4型荚膜多糖的伯羟基氧化为醛基的氧化位点包括β-D-ManpNAc、α-D-GalpNAc和/或α-D-Galp。6.根据权利要求5所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的硝酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩猛，张慢慢，严志红，李军强，朱涛，巢守柏，
申请(专利权)人：康希诺生物股份公司，
类型：发明
国别省市：天津,12