含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法，具体步骤包括：提取动物组织中的多糖，收集含糖醛酸多糖；酸水解得到二糖产物；加入还原胺试剂溶液，制备含糖醛酸多糖二糖的还原胺衍生物，采用高效液相色谱‑多级质谱检测，间接对含糖醛酸多糖实现定性分析。本发明专利技术还提供了上述含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的制备方法。本发明专利技术方法适用于分析和制备己糖醛酸‑氨基己糖和己糖醛酸‑己糖这两种类型的二糖；本发明专利技术采用酸降解，与酶法降解相比酸水解法成本低，操作简单，而且对各种多糖都有降解作用；用氨水替代常用的NaOH，因为氨水可挥发，易于除去，利于后期的质谱分析。

【技术实现步骤摘要】
含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法及制备方法
本专利技术涉及一种二糖的分析及制备方法，更具体，涉及含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法及制备方法。
技术介绍
动物组织中存在一些由糖醛酸与氨基己糖或己糖交替连接构成的含糖醛酸多糖。如肝素、硫酸软骨素、透明质酸等糖胺聚糖，都是由糖醛酸与氨基己糖连接而成的重复二糖片段构成。此外，在一些贝类等生物中还发现了糖醛酸与己糖连接而成的重复二糖片段构成的多糖，如鲍鱼性腺硫酸多糖AGSP等。已有研究证实，这些含糖醛酸多糖具有多种功能活性。由于具有显著的功能活性，一些含糖醛酸多糖已经被开发为药品和保健品等；此外，一些食品中存在的含糖醛酸多糖也被证实具有增强免疫力等生物活性。为了对含糖醛酸多糖产品进行质量控制和营养评价，有必要开发这些糖醛酸多糖的检测方法，而分析降解产生的二糖片段是实现这些多糖定性定量检测的有效途径。相对于多糖，寡糖分子量小，易于吸收，可能产生更显著的生理活性。但由于寡糖极性大，分子结构差别细微，因此对于寡糖的分离纯化技术仍具有挑战性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于实现含糖醛酸二糖的高效分析及制备，其中含糖醛酸二糖具体是指糖醛酸通过糖苷键连于己糖或氨基己糖构成的二糖。为达到上述目的，本专利技术提供了一种含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法，具体步骤如下：S1、采用酶法或碱法方法提取动物组织中的多糖；S2、将步骤S1制得的多糖用阴离子交换树脂处理，分别用1.3M和3M的NaCl溶液洗脱，收集的洗脱液超滤脱盐、冷冻干燥，得到含糖醛酸多糖；S3、将步骤S2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖产物；S4、将步骤T3制得的二糖产物用水溶解，然后依次加入还原胺试剂溶液、氰基硼氢化钠溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖产物与还原胺试剂、氰基硼氢化钠的最终摩尔浓度比为1:1～4:1～4；所述还原胺试剂为3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、4-氨基苯甲酸乙酯(p-ABEE)、4-氨基苯腈(p-ABN)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯腈(o-ABN)、2-氨基苯甲酸(o-ABA)、2-氨基苯甲酰胺(o-ABAD)或2-氨基吖啶酮(AMAC)中的任意一种；所述还原胺试剂溶液的浓度为0.1～0.4M，所述氰基硼氢化钠溶液的浓度为0.2～1.0M；所述二糖产物水溶液的浓度为0.05～0.1M；上述二糖产物多为二糖片段，是一种混合物，所述摩尔浓度根据所称多糖的重量除以一个二糖的分子量(按糖醛酸+己糖-水计算)得到的物质的量除以溶解用的水的体积粗略计算；再加入占所述混合溶液总体积5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制备含糖醛酸多糖二糖的还原胺衍生物，冷却至室温，浓缩或氮吹至干燥，加水溶解，所述还原胺衍生物的浓度为0.01M～0.05M，用氨水调pH至8～10；加入等体积的氯仿萃取，收集水相，重复三次，收集的水相作为供试液；S5、采用配备反相色谱柱的高效液相色谱-多级质谱(HPLC-MSn)检测步骤S4制得的供试液，指认目标色谱峰，根据不同还原胺衍生试剂的特征离子信号分析二糖还原胺衍生物，进而得出含糖醛酸二糖的种类；色谱条件：HypersilGOLDC18(150×2.1mm,5μm)色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵-乙腈(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，喷雾电压4.5kV，毛细管温度为275℃，毛细管电压为37V，鞘气：40AU，辅助气：10AU，正离子模式检测，扫描方式为全扫描(FullScan)，扫描范围为100-2000(m/z)。不同还原胺衍生试剂的特征离子信号如表1所示。表1为达到上述目的，本专利技术还提供了上述含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的制备方法，包括如下步骤：T1、采用酶法或碱法方法提取动物组织中的多糖；T2、将步骤T1制得的多糖用阴离子交换树脂处理，分别用1.3M和3M的NaCl溶液洗脱，收集的洗脱液超滤脱盐、冷冻干燥，得到含糖醛酸多糖；T3、将步骤T2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖产物；T4、将步骤T3制得的二糖产物用水溶解，然后依次加入还原胺试剂溶液、氰基硼氢化钠溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖产物与还原胺试剂、氰基硼氢化钠的最终摩尔浓度比为1:1～4:1～4；所述还原胺试剂为3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、4-氨基苯甲酸乙酯(p-ABEE)、4-氨基苯腈(p-ABN)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯腈(o-ABN)、2-氨基苯甲酸(o-ABA)、2-氨基苯甲酰胺(o-ABAD)或2-氨基吖啶酮(AMAC)中的任意一种；所述还原胺试剂溶液的浓度为0.1～0.4M，所述氰基硼氢化钠溶液的浓度为0.2～1.0M；所述二糖产物水溶液的浓度为0.05～0.1M；上述二糖产物多为二糖片段，是一种混合物，所述摩尔浓度根据所称多糖的重量除以一个二糖的分子量(按糖醛酸+己糖-水计算)得到的物质的量除以溶解用的水的体积粗略计算；再加入占所述混合溶液总体积5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制备含糖醛酸多糖二糖的还原胺衍生物，冷却至室温，浓缩或氮吹至干燥，加水溶解，所述还原胺衍生物的浓度为0.01M～0.05M，用氨水调pH至8～10；加入等体积的氯仿萃取，收集水相，重复三次，收集的水相作为供试液；上述还原胺衍生物的物质的量根据二糖产物的物质的量判断。T5、以体积浓度为15～40％的甲醇水溶液为流动相，采用制备型ODS反相色谱柱进行分离步骤T4制得的供试液，根据色谱峰收集含糖醛酸二糖还原胺衍生物的流份，在45℃、800rpm条件下真空冷冻离心浓缩至干燥，得到含糖醛酸二糖还原胺衍生物；色谱条件：半制备液相色谱系统(依利特)；SinoChromeODS-BP(10×300mm，5μm)色谱柱；柱温30℃；流速5mL/min；流动相为水(A)/甲醇(B)＝80/20等度洗脱；T6、向步骤T5制得的含糖醛酸二糖还原胺衍生物中加入由水、乙酸、体积浓度为30％的H2O2水溶液按体积比5～10:1:1混合制得的溶液，所述含糖醛酸二糖还原胺衍生物的终浓度为0.05～10mg/ml；30～70℃孵育12～24h，浓缩蒸发或氮吹至干燥；加水溶解并用等体积的氯仿萃取，收集水层、浓缩蒸发干燥，得到固相即为含糖醛酸二糖。此步骤先烘干再溶解，干燥时可达到除乙酸的目的，同时，减少氯仿用量。优选方式下，步骤T1所述酶解或碱解提取多糖的处理方法为：首先将动物组织预处理，搅碎或斩拌；所述酶解的具体过程为：将经过预处理的动物组织按质量体积比1:5～30(g/ml)置于pH＝8的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液，加入所述磷酸盐缓冲溶液10～20％体积的0.05mol/L半胱氨酸-EDTA-2Na溶液，再加入占所述动物组织质量0.5％的胰蛋白酶，37℃水浴震荡酶解4h，之后加入占所述动物组织质量0.5％的木瓜蛋白酶，65℃水浴震荡酶解3h，100℃灭酶，10000rpm离心20min，收集上清液，加入3倍体积的无水乙醇，醇沉，收集固相即为动物组织中的多糖；使用碱解的具体过程为：将经过预处理的动物组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法，其特征在于，具体步骤如下：S1、采用酶法或碱法方法提取动物组织中的多糖；S2、将步骤S1制得的多糖用阴离子交换树脂处理，分别用1.3M和3M的NaCl溶液洗脱，收集的洗脱液超滤脱盐、冷冻干燥，得到含糖醛酸多糖；S3、将步骤S2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖产物；S4、将步骤S3制得的二糖产物用水溶解，然后依次加入还原胺试剂溶液、氰基硼氢化钠溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖产物与还原胺试剂、氰基硼氢化钠的最终摩尔浓度比为1:1～4:1～4；所述还原胺试剂为3‑氨基‑9‑乙基咔唑、4‑氨基苯甲酸乙酯、4‑氨基苯腈、7‑氨基‑4‑甲基香豆素、2‑氨基苯腈、2‑氨基苯甲酸、2‑氨基苯甲酰胺或2‑氨基吖啶酮中的任意一种；所述还原胺试剂溶液的浓度为0.1～0.4M，所述氰基硼氢化钠溶液的浓度为0.2～1.0M；所述二糖产物水溶液的浓度为0.05～0.1M；再加入占所述混合溶液总体积5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制备含糖醛酸多糖二糖的还原胺衍生物，冷却至室温，浓缩或氮吹至干燥，加水溶解，所述还原胺衍生物的浓度为0.01M～0.05M，用氨水调pH至8～10；加入等体积的氯仿萃取，收集水相，重复三次，收集的水相作为供试液；S5、采用配备反相色谱柱的高效液相色谱‑多级质谱检测步骤S4制得的供试液，指认目标色谱峰，根据不同还原胺衍生试剂的特征离子信号分析二糖还原胺衍生物，进而得出含糖醛酸二糖的种类；色谱条件：Hypersil GOLD C18(150×2.1mm,5μm)色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵‑乙腈(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，喷雾电压4.5kV，毛细管温度为275℃，毛细管电压为37V，鞘气：40AU，辅助气：10AU，正离子模式检测，扫描方式为全扫描(Full Scan)，扫描范围为100‑2000(m/z)。...

【技术特征摘要】
1.一种含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的分析方法，其特征在于，具体步骤如下：S1、采用酶法或碱法方法提取动物组织中的多糖；S2、将步骤S1制得的多糖用阴离子交换树脂处理，分别用1.3M和3M的NaCl溶液洗脱，收集的洗脱液超滤脱盐、冷冻干燥，得到含糖醛酸多糖；S3、将步骤S2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖产物；S4、将步骤S3制得的二糖产物用水溶解，然后依次加入还原胺试剂溶液、氰基硼氢化钠溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖产物与还原胺试剂、氰基硼氢化钠的最终摩尔浓度比为1:1～4:1～4；所述还原胺试剂为3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯腈、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯腈、2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺或2-氨基吖啶酮中的任意一种；所述还原胺试剂溶液的浓度为0.1～0.4M，所述氰基硼氢化钠溶液的浓度为0.2～1.0M；所述二糖产物水溶液的浓度为0.05～0.1M；再加入占所述混合溶液总体积5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制备含糖醛酸多糖二糖的还原胺衍生物，冷却至室温，浓缩或氮吹至干燥，加水溶解，所述还原胺衍生物的浓度为0.01M～0.05M，用氨水调pH至8～10；加入等体积的氯仿萃取，收集水相，重复三次，收集的水相作为供试液；S5、采用配备反相色谱柱的高效液相色谱-多级质谱检测步骤S4制得的供试液，指认目标色谱峰，根据不同还原胺衍生试剂的特征离子信号分析二糖还原胺衍生物，进而得出含糖醛酸二糖的种类；色谱条件：HypersilGOLDC18(150×2.1mm,5μm)色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵-乙腈(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，喷雾电压4.5kV，毛细管温度为275℃，毛细管电压为37V，鞘气：40AU，辅助气：10AU，正离子模式检测，扫描方式为全扫描(FullScan)，扫描范围为100-2000(m/z)。2.权利要求1所述含糖醛酸二糖基于还原胺衍生化的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：T1、采用酶法或碱法方法提取动物组织中的多糖；T2、将步骤T1制得的多糖用阴离子交换树脂处理，分别用1.3M和3M的NaCl溶液洗脱，收集的洗脱液超滤脱盐、冷冻干燥，得到含糖醛酸多糖；T3、将步骤T2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖产物；T4、将步骤T3制得的二糖产物用水溶解，然后依次加入还原胺试剂溶液、氰基硼氢化钠溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖产物与还原胺试剂、氰基硼氢化钠的最终摩尔浓度比为1:1～4:1～4；所述还原胺试剂为3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯腈、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯腈、2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺或2-氨基吖啶酮中的任意一种；所述还原胺试剂溶液的浓度为0.1～0.4M，所述氰基硼氢化钠溶液的浓度为0.2～1.0M；所述二糖产物水溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，刘斌，艾春青，温成荣，孙玉姣，鲁姣姣，张豹，曹春阳，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21