一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明专利技术的自组装过氧化氢酶纳米颗粒通过将过氧化氢酶冻干粉溶解获得过氧化氢酶溶液，调整过氧化氢酶溶液的pH，然后经离心或过滤获得上清液或过滤液，将上清液或过滤液进一步热孵育而得。本发明专利技术的自组装过氧化氢酶纳米颗粒能够应用促进免疫细胞生长，调节机体免疫的药品或食品中。本发明专利技术具有制备方法绿色安全、制备方法操作简单、可精准控制且重现性明确、应用领域广泛等优点。

A Self-assembled Catalase Nanoparticles and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物、食品与纳米材料
，特别是涉及一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
过氧化氢酶(Catalase，CAT)是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内，是机体内重要的氧化还原平衡的组成，可消除机体内如过多过氧化氢等自由基，形成对机体免疫的重要屏障。近年来，外源性过氧化氢酶已广泛应用于免疫相关的肿瘤疾病治疗，亟需进一步开发基于过氧化氢酶具有更高生理活性的生物材料。目前国内外研究者开发了众多具有清除自由基的过氧化氢酶模拟药物，但这些模拟物制备路线复杂，且在体内的安全性尚不明确。当前，纳米科技在诸多领域备受关注，因其具有纳米尺度所带来的巨大优势，如可大大增强分子尺度下活性成分原本的功能性质，更易进入细胞、靶向性好、作用效率高等。基于此，众多研究聚焦在了过氧化氢酶纳米颗粒的研发上以期得到生理性能更显著的纳米生物材料，如利用剪切力结合有机试剂法，碳酸钙包裹法等，提高了过氧化氢酶本身的稳定性，然而这些方法均存在残留化学试剂，安全风险高，制备复杂不可控等诸多问题。目前国内外尚无自组装而成的过氧化氢酶纳米颗粒的制备与研究的相关报道。本专利技术利用在热处理条件下，蛋白质之间疏水作用加大，更易形成更大尺度超分子聚合物的原理，以牛肝来源的过氧化氢酶为原料，采用热加工孵育方式，控制温度以及pH以绿色制备有活性的过氧化氢酶纳米颗粒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒及其制备方法和应用。本专利技术的制备方法绿色安全，操作简单，得到的自组装过氧化氢酶纳米颗粒粒径可控，且具有较高的活性和稳定性。为了达到上述的目的，本专利技术采取以下技术方案：一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，包括将过氧化氢酶冻干粉溶解获得过氧化氢酶溶液，调整过氧化氢酶溶液的pH，然后经离心或过滤获得上清液或过滤液，将上清液或过滤液进一步热孵育而得。进一步地，所述制备方法中，所述过氧化氢酶溶液的浓度为0.2-5mg/mL；优选的，所述过氧化氢酶溶液的浓度为0.2-1.6mg/mL。进一步地，所述制备方法中，调整过氧化氢酶溶液的pH值为6.5-9.5；优选的，所述pH值为7.0-8.0。进一步地，所述制备方法中，所述离心的速度为2000-5000rpm/min。进一步地，所述制备方法中，所述过滤为膜过滤，膜过滤孔径为0.22μm-0.45μm。进一步地，所述制备方法中，所述热孵育为将上清液或过滤液在45-90℃的温度下加热15s-15min；本专利技术加热温度越高，所需的加热时间越短。例如在65-90℃的温度下仅需加热15-60s。本专利技术还提供上述制备方法获得的自组装过氧化氢酶纳米颗粒，所述自组装过氧化氢酶纳米颗粒的粒径为30-200nm。进一步地，所述自组装过氧化氢酶纳米颗粒的酶活力≥3100U/mg。本专利技术还提供一种上述自组装过氧化氢酶纳米颗粒在食品或药品中的应用。进一步地，所述自组装过氧化氢酶纳米颗粒在具有免疫调节功能的食品或药品中的应用。本专利技术的原理：本专利技术利用离心和过滤的手段除去过氧化氢酶冻干粉中的过大的聚合物杂质，然后在热处理条件下，过氧化氢酶蛋白质之间疏水作用加大，从而易形成更大尺度超分子聚合物，自组装形成具有更大纳米尺寸的自组装过氧化氢酶纳米颗粒。本专利技术具有以下技术特点：(1)本专利技术涉及的自组装过氧化氢酶纳米颗粒制备绿色安全，无需化学交联与构造，操作简单。(2)本专利技术涉及的自组装过氧化氢酶纳米颗粒可通过调整体系的pH精确制备不同粒径大小的自组装过氧化氢酶纳米颗粒，由此产生不同的生理效应，且所得自组装纳米过氧化氢酶粒径分布集中，均一。(3)本专利技术涉及的自组装过氧化氢酶纳米颗粒相比原来天然过氧化氢酶，稳定性大大提高。附图说明图1不同pH对自组装过氧化氢酶纳米颗粒形成的影响：a)平均粒径图；b)Zeta-potential电位图。图2自组装过氧化氢酶纳米颗粒的粒径分布:a)，b)，c)分别为pH7.0，7.2，8.0条件下形成的过氧化氢酶纳米颗粒。图3自组装过氧化氢酶纳米颗粒SDS-PAGE图:a)非还原型电泳，从左至右为不同pH条件(pH7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0)溶解的天然CAT与CAT纳米颗粒(pH7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0)；b)还原型电泳(顺序如前)。图4自组装过氧化氢酶纳米颗粒的SEM电镜观察图(a)及圆二色谱图(b)。图5不同pH下制备的自组装过氧化氢酶纳米颗粒的酶活。图6不同pH下制备的自组装过氧化氢酶纳米颗粒对巨噬细胞生存率的影响。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。实施例1称取过氧化氢酶冻干粉0.8mg，溶解于1mLpH7.0，0.02M的磷酸盐缓冲液中，振荡使之充分溶解，5000rpm/min离心转速下离心10min后选取上清液，至于1.5mL离心管中。然后将离心管至干热孵育器中，60℃下保温孵育10min，即得到自组装过氧化氢酶纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径和表面电位，测定粒径为134.90±3.18nm，表面电荷范围在-11.40±1.07mV，见图1，图1中的天然是指未经处理的过氧化氢酶；自组装过氧化氢酶纳米颗粒粒度分布见图2；其SDS-PAGE电泳图见图3；SEM电镜图，CD光谱图见图4，自组装过氧化氢酶纳米颗粒其酶活力为7732.50±235.74U/mg，见图5。实施例2称取过氧化氢酶冻干粉0.8mg，溶解于1mLpH7.2，0.02M的磷酸盐缓冲液中，振荡使之充分溶解，5000rpm/min离心转速下离心10min后选取上清液，至于1.5mL离心管中。然后将离心管至干热孵育器中，60℃下保温孵育10min，即为自组装过氧化氢酶纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径和表面电位，测定粒径为63.40±1.23nm，表面电荷范围在-27.0±2.21mV，见图1；自组装过氧化氢酶纳米颗粒纳米颗粒粒度分布见图2；自组装过氧化氢酶纳米颗粒纳米颗粒粒度分布见图2；其SDS-PAGE电泳图见图3；SEM电镜图，CD光谱图见图4，自组装过氧化氢酶纳米颗粒其酶活力为7382.50±221.77U/mg，见图5。实施例3称取过氧化氢酶冻干粉0.8mg，溶解于1mLpH(7.4～8.0)，0.02M的磷酸盐缓冲液中，振荡使之充分溶解，5000rpm/min离心转速下离心10min后选取上清液，至于1.5mL离心管中。然后将离心管至干热孵育器中，60℃下保温孵育10min，即为自组装过氧化氢酶纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径和表面电位，测定粒径约为40nm，表面电荷范围在-15.6～-19.5mV，见图1；自组装过氧化氢酶纳米颗粒粒度分布见图2；其SDS-PAGE电泳图见图3；SEM电镜图，CD光谱图见图4，纳米颗粒其酶活力≥3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括将过氧化氢酶冻干粉溶解获得过氧化氢酶溶液，调整过氧化氢酶溶液的pH，然后经离心或过滤获得上清液或过滤液，将上清液或过滤液进一步热孵育而得。

【技术特征摘要】
1.一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括将过氧化氢酶冻干粉溶解获得过氧化氢酶溶液，调整过氧化氢酶溶液的pH，然后经离心或过滤获得上清液或过滤液，将上清液或过滤液进一步热孵育而得。2.根据权利要求1所述的一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述过氧化氢酶溶液的浓度为0.2-5.0mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，调整过氧化氢酶溶液的pH值为6.5-9.5。4.根据权利要求1所述的一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述离心的速度为2000-5000rpm/min。5.根据权利要求1所述的一种自组装过氧化氢酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述过滤为膜过...

【专利技术属性】
技术研发人员：余兆硕，柯李晶，高观祯，汪惠勤，周建武，饶平凡，罗思浩，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33