使用连接扩增的分子检测制造技术

本文公开了用于使用检测分子检测样品中的靶分子的组合物、试剂盒、方法和系统。

Molecular detection using linkage amplification

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用连接扩增的分子检测交叉引用本申请要求于2016年12月16日提交的美国临时申请号62/435,424、于2017年3月31日提交的美国临时申请号62/480,107和于2017年5月23日提交的美国临时申请号62/509,995的权益，所述临时申请中的每一个通过引用以其全文并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是基于国立卫生研究授予的NINDS基金SBIR1R43NS092180-01在政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
传统第二抗体染色产生平均每个第一抗体大致约15个荧光团的信号，而获得与之相当的信号水平可能具有挑战性。多重标记的反义寡聚体可以提供每个第一抗体大致几个荧光团的信号，但是反义寡聚体的密集标记可能导致荧光团之间的猝灭。本文公开了连接扩增方法以提供与第二抗体扩增相当的更高的信号强度。
技术实现思路
本文公开了用于检测样品中的靶分子的组合物、试剂盒、方法和系统。在一个方面，本文公开了方法，其包括使样品中的靶分子与检测偶联体接触，其中所述检测偶联体包含第一核酸和第二核酸，其中每个核酸具有靶识别区和自身杂交区，其中所述第一核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第一区域结合，其中所述第二核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第二区域结合，并且其中所述第一核酸的所述自身杂交区和所述第二核酸的所述自身杂交区进行杂交以形成双链核酸标记。在一些情况下，所述双链核酸标记具有至少两个连续碱基对，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200或至少250个连续碱基对。在一些情况下，所述双链核酸标记具有突出端。在一些情况下，所述突出端具有至少1个未配对核苷酸，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200或至少250个未配对核苷酸。在一些情况下，所述靶分子是RNA分子。在一些情况下，所述靶分子是mRNA分子。在一些情况下，所述第一核酸和所述第二核酸是单链DNA。在一些情况下，所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被2至15个核苷酸间隔开。在一些情况下，所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被2至5个核苷酸间隔开。在一些情况下，所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被5至10个核苷酸间隔开。在一些情况下，所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被10至15个核苷酸间隔开。在一些情况下，所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被15至20个核苷酸间隔开。在一些情况下，所述方法进一步包括使用交联剂将所述检测偶联体固定至所述样品。在一些情况下，所述第一核酸或所述第二核酸具有游离胺(-NH2)修饰。在一些情况下，固定所述检测偶联体包括使所述检测偶联体与胺特异性交联剂接触。在一些情况下，所述突出端包含一个核苷酸。在一些情况下，所述突出端包含多个核苷酸。在一些情况下，所述突出端包含至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸。在一些情况下，所述方法进一步包括使所述双链核酸标记与DNA连接酶接触。在一些情况下，所述方法进一步包括使所述双链核酸标记与至少一个检测标记接触。在一些情况下，所述至少一个检测标记是具有与所述双链核酸标记的所述突出端互补的突出端的双链核酸。在一些情况下，所述至少一个检测标记是与所述双链核酸标记的所述突出端互补的单链核酸。在一些情况下，所述至少一个检测标记包括多个检测标记。在一些情况下，使用DNA连接酶将所述双链核酸标记和所述至少一个检测标记连接。在一些情况下，所述至少一个检测标记包括至少5、10、15、20、25或30个检测标记。在一些情况下，所述至少一个检测标记包含可切割接头。在一些情况下，所述至少一个检测标记不包含可切割接头。在一些情况下，所述至少一个检测标记包含检测标签。在一些情况下，所述至少一个检测标记包含多个检测标签。在一些情况下，所述检测标签包括量子点。在一些情况下，所述检测标签包括荧光团。在一些情况下，所述荧光团包括香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素或花菁。在一些情况下，所述方法包括检测所述检测标签，从而检测所述样品中所述靶分子的存在。在一些情况下，所述方法包括使所述样品与多个检测偶联体接触。在一些情况下，所述多个检测偶联体中的每一个与不同的靶分子结合。在一些情况下，所述样品是完整的组织样品。在一些情况下，所述方法包括将所述完整的组织样品包埋到树脂中，使得所述完整的组织样品可以切成厚度在20至1000nm之间的切片。在一些情况下，所述完整的组织样品是骨髓组织样品、胃肠道组织样品、肺组织样品、肝组织样品、前列腺组织样品、神经系统组织样品、泌尿生殖系统组织样品、脑组织样品、乳腺组织样品、肌肉组织样品或皮肤组织样品。在一些情况下，所述方法包括所述完整的组织样品的脱水。在一些情况下，所述方法不包括所述完整的组织样品的脱水。在一些情况下，所述方法包括诊断与所述样品中的所述靶分子的存在相关的病况或疾病。在一些情况下，所述病况或疾病是肾病、感染性疾病、代谢疾病、癌前病况、癌性病况或脑病症。在一些情况下，所述样品是石蜡包埋的组织样品。在一些情况下，所述样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。在一些情况下，所述方法进一步包括使所述双链核酸标记与第三核酸接触，其中所述第三核酸包含与所述第一核酸的序列、所述第二核酸的序列或两者互补的序列。在一个实例中，所述第三核酸包含与所述第一核酸的序列互补的序列。在一个实例中，所述第三核酸包含与所述第二核酸的序列互补的序列。在一个实例中，所述第三核酸包含与所述第一核酸的序列和所述第二核酸的序列互补的序列。在一些情况下，所述第三核酸与所述第一核酸的所述序列、所述第二核酸的所述序列或两者结合。在一个实例中，所述第三核酸与所述第一核酸的所述序列结合。在一个实例中，所述第三核酸与所述第二核酸的所述序列结合。在一个实例中，所述第三核酸与所述第一核酸的所述序列和所述第二核酸的所述序列结合。在一些情况下，所述双链核酸标记中的所述第一核酸和所述第二核酸各自具有至少一个未配对核苷酸。在一些情况下，所述双链核酸标记中的所述第一核酸和所述第二核酸各自具有至少1个未配对核苷酸，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200或至少250个未配对核苷酸。在一些情况下，所述第三核酸包含与所述第一核酸的未配对序列、所述第二核酸的未配对序列或两者互补的序列。在一些情况下，所述第三核酸包含与所述第一核酸的全部未配对序列互补的序列。在一些情况下，所述第三核酸包含与所述第二核酸的全部未配对序列互补的序列。在一些情况下，所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，其包括使样品中的靶分子与检测偶联体接触，其中所述检测偶联体包含第一核酸和第二核酸，其中每个核酸具有靶识别区和自身杂交区，其中所述第一核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第一区域结合，其中所述第二核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第二区域结合，并且其中所述第一核酸的所述自身杂交区和所述第二核酸的所述自身杂交区进行杂交以形成双链核酸标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.16 US 62/435,424;2017.03.31 US 62/480,107;1.一种方法，其包括使样品中的靶分子与检测偶联体接触，其中所述检测偶联体包含第一核酸和第二核酸，其中每个核酸具有靶识别区和自身杂交区，其中所述第一核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第一区域结合，其中所述第二核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第二区域结合，并且其中所述第一核酸的所述自身杂交区和所述第二核酸的所述自身杂交区进行杂交以形成双链核酸标记。2.如权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸标记具有至少三个连续碱基对。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述双链核酸标记具有突出端。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶分子是mRNA分子。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸是单链DNA。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述靶分子的所述第一区域和所述第二区域被2至15个核苷酸间隔开。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括使用交联剂将所述检测偶联体固定至所述样品。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一核酸或所述第二核酸具有游离胺(-NH2)修饰。9.如权利要求7或8所述的方法，其中固定所述检测偶联体包括使所述检测偶联体与胺特异性交联剂接触。10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述突出端包含一个核苷酸。11.如权利要求3至10中任一项所述的方法，其中所述突出端包含多个核苷酸。12.如权利要求11所述的方法，其中所述突出端包含至少5、10、15、20、25或30个核苷酸。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其进一步包括使所述双链核酸标记与DNA连接酶接触。14.如权利要求13所述的方法，其进一步包括使所述双链核酸标记与至少一个检测标记接触。15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一个检测标记是具有与所述双链核酸标记的所述突出端互补的突出端的双链核酸。16.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一个检测标记是与所述双链核酸标记的所述突出端互补的单链核酸。17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含多个检测标记。18.如权利要求14或15所述的方法，其中使用所述DNA连接酶将所述双链核酸标记与所述至少一个检测标记连接。19.如权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包括至少5、10、15、20、25或30个检测标记。20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含可切割接头。21.如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含检测标签。22.如权利要求21所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含多个检测标签。23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述检测标签包括量子点。24.如权利要求21或22所述的方法，其中所述检测标签包括荧光团。25.如权利要求24所述的方法，其中所述荧光团包括香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素或花菁。26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其包括检测所述检测标签，从而检测所述样品中所述靶分子的存在。27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其包括使所述靶分子与多个检测偶联体接触。28.如权利要求27所述的方法，其中所述多个检测偶联体中的每一个与不同的靶分子结合。29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述样品是完整的组织样品。30.如权利要求29所述的方法，其包括将所述完整的组织样品包埋到树脂中，使得所述完整的组织样品可以切成厚度在20至1000nm之间的切片。31.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其包括诊断与所述样品中的所述靶分子的所述存在相关的病况或疾病。32.一种方法，其包括使样品中的靶分子与检测分子和反义寡聚体接触，其中所述检测分子包含与所述靶分子结合的至少一个配体，其中所述至少一个配体与单链核酸连接，并且其中所述单链核酸与所述反义寡聚体杂交以形成具有突出端的双链核酸标记。33.如权利要求32所述的方法，其中所述配体是抗体。34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述靶分子是蛋白质。35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述突出端包含一个核苷酸。36.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述突出端包含多个核苷酸。37.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述突出端包含至少5、10、15、20、25或30个核苷酸。38.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其进一步包括使所述双链核酸标记与DNA连接酶接触。39.如权利要求32至38中任一项所述的方法，其进一步包括使所述双链核酸标记与至少一个检测标记接触。40.如权利要求39所述的方法，其中所述至少一个检测标记是具有与所述双链核酸标记的所述突出端互补的突出端的双链核酸。41.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一个检测标记是多个检测标记。42.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一个检测标记是与所述双链核酸标记的所述突出端互补的单链核酸。43.如权利要求41至42中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包括多个检测标记。44.如权利要求39至43中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包括至少5、10、15、20、25或30个检测标记。45.如权利要求32至44中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含可切割接头。46.如权利要求32至44中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记不包含可切割接头。47.如权利要求32至46中任一项所述的方法，其中所述至少一个检测标记包含检测标签。48.如权利要求47所述的方法，其中所述检测标签包括荧光团。49.如权利要求48所述的方法，其中所述荧光团包括香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素或花菁。50.如权利要求47至49中任一项所述的方法，其包括检测所述检测标签，从而检测所述样品中所述靶分子的存在。51.如权利要求32至50中任一项所述的方法，其包括使所述样品与多个检测分子接触。52.如权利要求51所述的方法，其中所述多个检测分子中的每一个与不同的靶分子结合。53.如权利要求32至52中任一项所述的方法，其中所述样品是完整的组织样品。54.如权利要求53所述的方法，其包括将所述完整的组织样品包埋到树脂中，使得所述完整的组织样品可以切成厚度在20至1000nm之间的切片。55.如权利要求29或53所述的方法，其中所述完整的组织样品是骨髓组织样品、胃肠道组织样品、肺组织样品、肝组织样品、前列腺组织样品、神经系统组织样品、泌尿生殖系统组织样品、脑组织样品、乳腺组织样品、肌肉组织样品或皮肤组织样品。56.如权利要求26或50所述的方法，其包括诊断与所述样品中的所述靶分子的所述存在相关的病况或疾病。57.如权利要求56所述的方法，其中所述病况或疾病是肾病、感染性疾病、代谢疾病、癌前病况、癌性病况或脑病症。58.一种组合物，其包含：检测偶联体，其中所述检测偶联体包含第一核酸和第二核酸，其中每个核酸具有靶识别区和自身杂交区，其中所述第一核酸的所述靶识别区与靶分子的所述区域结合，其中所述第二核酸的所述靶识别区与所述靶分子的第二区结合，并且其中所述第一核酸的所述自身杂交区和所述第二核酸的所述自身杂交区进行杂交以形成双链核酸标记。59.如权利要求58所述的组合物，其中所述双链核酸标记具有至少三个连续碱基对。60.如权利要求58或59所述的组合物，其中所述双链核酸标记具有突出端。61.如权利要求60所述的组合物，其中所述突出端包含一个核苷酸。62.如权利要求60所述的组合物，其中所述突出端包含多个核苷酸。63.如权利要求60所述的组合物，其中所述突出端包含至少5、10、15、20、25或30个核苷酸。64.如权利要求58至63中任一项所述的组合物，其中所述靶分子是mRNA分子。65.如权利要求58至64中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸是单链DNA。66.如权利要求58至65中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸或所述第二核酸中的每一个具有游离胺(-NH2)修饰。67.如权利要求58至66中任一项所述的组合物，其进一步包含DNA连接酶。68.如权利要求58至67中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一个检测标记。69.如权利要求68所述的组合物，其中所述至少一个检测标记是具有与所述双链核酸标记的所述突出端互补的突出端的双链核酸。70.如权利要求68所述的组合物，其中所述至少一个检测标记是与所述双链核酸标记的所述突出端互补的单链核酸。71.如权利要求68或70中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包括多个检测标记。72.如权利要求69或70所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包括至少5、10、15、20、25或30个检测标记。73.如权利要求68至72中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包含可切割接头。74.如权利要求68至73中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包含检测标签。75.如权利要求74所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包含多个检测标签。76.如权利要求74或75所述的组合物，其中所述检测标签包括量子点。77.如权利要求74或75所述的组合物，其中所述检测标签包括荧光团。78.如权利要求77所述的组合物，其中所述荧光团包括香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素或花菁。79.一种组合物，其包含：检测分子和反义寡聚体，其中所述检测分子包含与靶分子结合的至少一个配体，其中所述至少一个配体与单链核酸连接，并且其中所述单链核酸与所述反义寡聚体杂交以形成具有突出端的双链核酸标记。80.如权利要求79所述的组合物，其中所述配体是抗体。81.如权利要求79或80所述的组合物，其中所述靶分子是蛋白质。82.如权利要求79至81中任一项所述的组合物，其中所述突出端包含一个核苷酸。83.如权利要求79至81中任一项所述的组合物，其中所述突出端包含多个核苷酸。84.如权利要求79至81中任一项所述的组合物，其中所述突出端包含至少5、10、15、20、25或30个核苷酸。85.如权利要求79至84中任一项所述的组合物，其进一步包含DNA连接酶。86.如权利要求79至85中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一个检测标记。87.如权利要求86所述的组合物，其中所述至少一个检测标记是具有与所述双链核酸标记的所述突出端互补的突出端的双链核酸。88.如权利要求86所述的组合物，其中所述至少一个检测标记是与所述双链核酸标记的所述突出端互补的单链核酸。89.如权利要求86至88中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包括多个检测标记。90.如权利要求86至89中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包括至少5、10、15、20、25或30个检测标记。91.如权利要求86至90中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记包含可切割接头。92.如权利要求86至90中任一项所述的组合物，其中所述至少一个检测标记不包含可切割接头。93.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰伊·特劳特曼，戈登·王，大卫·伦齐，
申请(专利权)人：艾瑞特姆有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US