一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，该检测方法包括如下步骤：(1)根据第一个目标物miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标物miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2，所述发卡信号链H1和H2分别修饰6‑羧基荧光素(FAM)和羧基四甲基罗丹明(TMR)并且组装在同一个纳米金表面；(2)在目标miRNA存在时引发级联催化发夹组装反应；(3)FAM和TMR相互靠近发生荧光共振能量转移效应，实现miRNA荧光定量分析。该检测方法灵敏度高，特异性好，稳定性强，操作简单，为miRNA检测提供了新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法
本专利技术属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法。
技术介绍
MiRNAs是一系列由内源基因编码的单链，小(大约19-25个核苷酸)的非编码RNA，miRNA因其在进化上高度保守的特性可以作为基因表达的关键控制因子，通常在转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢等过程。由于miRNA能够很好地识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。大量的研究表明miRNA作为生物标志物与多种疾病的病理生理过程密切相关，miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包括心血管疾病，肝肾损伤，神经发育失常，甚至癌症。[Nature，2012，482，347.]所以在疾病的诊断以及治疗过程中miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。目前为止，通用的miRNA检测方法包括：NorthernBlotting印迹法，miRNA微阵列荧光检测法，和qRT-PCR。[Chem.Rev.，2013，113，6207.]其中NorthernBlotting印迹法是最经典的miRNA检测手段，但是它本身步骤繁琐，检测灵敏度较低，耗时长，并且需要大量的样品。而miRNA微阵列荧光检测法，虽然可以实现高通量检测，但该方法的重现性和精密度较差。qRT-PCR检测方法具有高灵敏度，高精度的特点，但是步骤繁琐，实验条件要求严格，并且对操作人员具有一定的技能要求。这些方法常常需要昂贵的仪器，复杂的操作，对miRNA进行标记等，无法满足miRNA床边检测的要求：不需要标记，在检测非常少的样品中miRNA具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好地区分miRNA家族中1-2碱基的错配，廉价且便携适用于小型临床等。DNA分子信标修饰的纳米金探针可以实现对miRNA进行简单快速高灵敏地检测，分子信标与目标miRNA分子配对后发生结构的转变会引起荧光信号的出现，最终实现miRNA的检测。[Chem.Commun.，2016，52，4569]但是这些技术中存在一个明显的问题，每一次信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗，而miRNA分子表达往往十分有限，所以上述的技术在实现miRNA分子的检测具有很大的限制。因此，为了克服现有技术中miRNA分子检测的困难，本专利技术人发现利用级联的DNA链循环反应实现两种miRNA同时检测的方法，该检测方法具有较高的选择性和特异性，操作简单等特点，为建立快速简便的新型miRNA检测方法提供了新思路。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，解决了现有技术中的检测方法需要大量的目标miRNA等缺点。本专利技术提供一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法：(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；(4)体外荧光定量分析。通过上述简单的步骤，本专利技术提供了一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，该方法操作简单、不需要对目标miRNA进行标记和PCR扩增，具有成本低廉等优势。在所述步骤(1)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2的5’端修饰有巯基和10个T碱基，所述的DNA发卡信号链H1的3’端修饰6-羧基荧光素(FAM)，所述的DNA发卡信号链H2的3’端修饰羧基四甲基罗丹明(TMR)。所述的DNA信号链H1，DNA信号链H2，DNA燃料链H1，DNA燃料链H2均通过分子内退火杂交的方法形成发卡结构。通过调整DNA发卡信号链和DNA发卡燃料链上的识别区域，本专利技术所提供的方法可以根据目标miRNA的碱基进行适应性调整，从而满足各种不同的检测要求。在所述步骤(2)中，所述的球形纳米金粒径为15nm，将具有荧光素的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2组装到球形纳米金表面，由于球形纳米金的荧光淬灭作用，FAM和TMR的荧光被淬灭，通过该步骤，背景荧光得以降低，从而提高灵敏度。在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2通过巯基和金之间的金硫键组装到球形纳米金表面，即为设计的纳米探针，该金硫键可将信号链牢牢地固定于球形纳米金表面，无需其他辅助分子维持信号链在界面上的形态和取向。在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间的摩尔比经过优化为1∶4。在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA引发级联催化发夹组装反应，目标miRNA打开DNA发卡信号链，DNA信号链未与目标miRNA结合的部分打开DNA发卡燃料链，DNA信号链与DNA燃料链杂交后将目标miRNA竞争下来，目标miRNA与下一个DNA发卡信号链杂交，开启新一轮循环反应。在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA与DNA发卡信号链之间、所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间杂交均为完全互补杂交，即DNA发卡信号链不具有缺口地与目标miRNA互补，DNA发卡信号链不具有缺口地与DNA发卡燃料链互补，利用核酸之间的氢键作用以及DNA之间的碱基堆积作用增强了杂交反应的稳定性。在所述步骤(3)中，第一个目标miRNA与DNA发卡信号链H1结合、第二个目标miRNA与DNA发卡信号链H2结合后，FAM荧光供体和TMR荧光受体之间会产生荧光共振能量转移信号，当目标miRNA不存在时，DNA发卡信号链不会被打开，FAM和TMR之间不产生荧光共振能量转移信号。在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的浓度为0.01-250nM。在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的序列选自：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10。当所述miRNA的序列选自SEQIDNO：3-SEQIDNO：8时，本专利技术的方法能够很好地区分miRNA-21家族和miRNA-200c家族中的单碱基错配，具有良好的特异性。当所述miRNA的序列选自SEQIDNO：9-SEQIDNO：10时，具有良好的选择性。在所述步骤(4)中，将目标miRNA与纳米探针在37℃恒温孵育1h，反应后取200μL到全黑96孔板中，荧光信号的测定使用荧光酶标仪，激发波长为492nm，分别在518nm和582nm处收集荧光发射信号。步骤简单，检测方法成本低廉。总之，本方法所提供的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法是一种高灵敏度的检测miRNA的方法，从而解决了现有技术中需要大量的测试样品(miRNA)的难点，并且检测的特异性好，选择性高，能够很好地区分同组的miRNA的碱基错配。与利用单链DNA探针相比，本专利技术的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；(4)体外荧光定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；(4)体外荧光定量分析。2.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2的5’端修饰有巯基和10个T碱基，所述的DNA发卡信号链H1的3’端修饰6-羧基荧光素(FAM)，所述的DNA发卡信号链H2的3’端修饰羧基四甲基罗丹明(TMR)。3.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的DNA信号链H1，DNA信号链H2，DNA燃料链H1，DNA燃料链H2均通过分子内退火杂交的方法形成发卡结构。4.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的球形纳米金的粒径为15nm，通过巯基和纳米金之间的金硫键将所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2组装到球形纳米金表面，即为设计的纳米探针。5.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间的摩尔比为1∶4。6.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA引发级联催化发夹组装反应，目标miRNA打开DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：余伯阳，田蒋为，高涵，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32