检测目标碱基序列的方法、设计和制造探针的方法以及试剂盒技术

本发明专利技术的课题在于提供能够使核酸试样中是否存在目标碱基序列的判断变得容易的检测目标碱基序列的方法等。向核酸试样中添加荧光标记检测探针和竞争探针并使其与试样中的核酸杂交，在使反应试样的温度变化的同时测定荧光强度，对温度‑荧光强度曲线进行一阶微分。荧光标记检测探针及竞争探针的碱基长度、碱基序列、向核酸试样的添加量以如下的条件决定：向含目标碱基序列的对照目标核酸试样和含非目标碱基序列的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，使所得的对照目标反应试样和对照非目标反应试样各自的温度变化的同时，测定荧光强度，对温度‑荧光强度曲线进行一阶微分时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。

Detection of target base sequence, design and fabrication of probes and kits

The subject of the present invention is to provide a method for detecting a target base sequence in a nucleic acid sample, which can make it easy to judge whether there is a target base sequence or not. Fluorescence labeling probe and competitive probe were added to the nucleic acid sample and hybridized with nucleic acid in the sample. The fluorescence intensity was measured while the temperature of the reaction sample changed. The temperature-fluorescence intensity curve was first-order differentiated. The base length, base sequence and addition amount of fluorescent labeling probe and competitive probe to nucleic acid sample are determined by the following conditions: fluorescent labeling probe and competitive probe are added to the target nucleic acid sample containing target nucleic acid sequence and the non-target nucleic acid sample containing non-target nucleic acid sequence, respectively, to make the obtained target reaction sample and the control non-target reaction sample. The fluorescence intensity of the sample is measured at the same time as the temperature changes. When the temperature fluorescence intensity curve is first-order differential, the first-order differential curve of the target reaction sample has a peak, while the first-order differential curve of the non-target reaction sample has no peak in essence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测目标碱基序列的方法、设计和制造探针的方法以及试剂盒
本专利技术涉及检测目标碱基序列的方法，更具体涉及检测包含例如单核苷酸多态性(SNP:singlenucleotidepolymorphism)等单碱基变异的目标碱基序列的方法、用于该方法的探针的设计方法及制造方法以及包含该探针的试剂盒。
技术介绍
SNP是指在个体间以超过个体的全体整体的1％的频度存在的基因组序列中的1个核苷酸替换为不同的核苷酸的变异。SNP中存在导致体质、疾病敏感性、药剂应答性等多种多样的表型的个体差异的变异。例如，已知人的酒精分解能力依赖于ALDH2基因的SNP，还已知与药物代谢的CYP家族中存在的SNP分别有助于药剂对人的效果。此外，近年来作为预测癌症的术后过程和治疗效果的生物标志物报道了特定的SNP，判别SNP的实用性高。另外，用于判别SNP的判别单碱基差异的技术不仅限于SNP，还可有效地应用于包含单碱基取代造成的突变(点突变)的碱基序列的判别，例如也可用于存在频度低于1％的抗药性病原菌的检测。因此，预测可简易地鉴定碱基序列间的单碱基差异的方法的需求将不断增加。作为SNP的简便的判别法，已知探针检测法。探针检测法是利用使具有与检测对象的碱基序列互补的碱基序列的检测探针杂交而得的完全匹配的双链的Tm值比使上述检测探针与同检测对象的碱基序列存在单碱基差异的碱基序列的核酸杂交而得的单碱基错配的双链Tm值高5℃左右这点，通过Tm值的差来判别碱基序列的方法。Tm值根据检测对象的碱基序列的碱基组成、反应试样的盐浓度等条件而变化，所述条件成为噪声而可能会难以获得稳定的测定结果。因此，考虑了减低所述噪声的改良方案。例如，专利文献1中揭示了使“检测型探针”的部分区域与目标核酸的包含单碱基变异位点的区域的3'末端侧和5'末端侧中的一方杂交，使具有除单碱基变异位点以外与检测型探针部分一致的碱基序列的“部分竞争型探针”的部分区域与其中的另一方杂交，在包含单碱基变异位点的区域使检测型探针与部分竞争型探针的剩余部分相互竞争的方法，即检测型探针和部分竞争型探针均可与目标核酸中分别对应的区域杂交，但这两种探针在包含单碱基变异位点的区域相互竞争的方法。该方法中，作为竞争部分的“包含单碱基变异位点的区域”中的变异识别能力提高，同时可降低单碱基错配的杂交的稳定度，所以可提高基于与完全匹配的情况的Tm值差的判别的精度。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利第5597939号专利技术的概要专利技术所要解决的技术问题然而，专利文献1中记载的方法中，通过Tm值的差异判别核酸试样所含的碱基序列对于检测探针的碱基序列完全匹配还是单碱基错配这点并没变。本专利技术人发现基于Tm值的差异的判别法中，可能会因盐浓度等实验条件、来源于试样的夹杂物、制备误差等而出现错误判定，从防止错误判定并使有无单碱基取代的判断变得简单的观点来看，还有改善的余地。如专利文献1中也采用的那样，Tm值的测定使用例如QP(淬灭探针/引物，QuenchingProbe/Primer)法等检测识别检测探针的荧光染料伴随核酸与检测探针的杂交或解离的淬灭或发光的方法。所述方法中，使向核酸试样中添加检测探针的反应试样的温度变化的同时测定荧光强度，将对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分而得的曲线所具有的峰(极大值)(与发生淬灭或发光的温度对应)作为Tm值。通过该Tm值的差异判别SNP的方法中，需要判定所测定的Tm值位于高温侧还是低温侧，可能会因误差等而难以判定，或者导致错误判定。另外，例如作为SNP判别的目标的核酸为SNP的2个等位基因的杂合子的情况下，有时在高温侧的Tm值与低温侧的Tm值之间的温度下可见淬灭或发光的峰。所述情况下，测定结果的Tm值与高温侧或低温侧的Tm值的差小至例如2℃左右，难以判别。于是，本专利技术的目的在于提供能够使核酸试样中是否存在目标碱基序列的判断变得容易的检测目标碱基序列的方法、用于该方法的试剂盒以及设计和制造用于该方法的探针的方法。解决技术问题所采用的技术方案为了解决上述课题，本专利技术人在不断认真研究的过程中发现，通过使用与单碱基错配的碱基序列特异性杂交的竞争探针抑制检测探针的单碱基错配的杂交，使低温侧的Tm值下不会发生消光或发光，能够实现仅检测目标碱基序列的检测体系。另外，本专利技术人还发现，如果对根据检测探针与核酸的杂交的反应试样得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分，通常在Tm值的温度伴随消光或发光出现一阶微分曲线的峰，此时通过抑制检测探针的单碱基错配的杂交，使该峰不会出现，可明确地判别通过目标碱基序列的检测出现峰的情况，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及以下的事项。[1]一种从核酸试样检测包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列(A)的方法，其中，该方法包括以下的步骤：(1)向核酸试样中加入用可用于QP(消光探针/引物)法的荧光染料标记的检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列(A)的目标核酸杂交的步骤，(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(3)对由(2)的测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分的步骤；在此，(i)荧光标记检测探针的碱基序列包含与目标碱基序列(A)互补的碱基序列(A')，(ii)竞争探针的碱基序列包含与碱基序列除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列(A)相同的非目标碱基序列(B)互补的碱基序列(B')，(iii)荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量以如下的条件决定：如果按照以下的步骤：(a)向含目标核酸、但实质上不含具有非目标碱基序列(B)的非目标核酸的对照目标核酸试样和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得对照目标反应试样和对照非目标反应试样的步骤，(b)改变各对照反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(c)对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线分别进行一阶微分的步骤操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。[2]根据[1]所述的方法，其中，还包括以下的步骤：(4)当(3)中得到的一阶微分曲线具有峰的情况下，判断为核酸试样中存在目标碱基序列(A)的步骤；在此，核酸试样除目标核酸以外还可包含非目标核酸。[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少5℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值低。[4]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值低。[5]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值不高于荧光标记检测探针的Tm值+5℃。[6]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少15℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值不高于荧光标记检测探针的Tm值+5℃。[7]根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从核酸试样检测包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列(A)的方法，其中，该方法包括以下的步骤：(1)向核酸试样中加入用可用于QP(消光探针/引物，Quenching Probe/Primer)法的荧光染料标记的检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列(A)的目标核酸杂交的步骤，(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(3)对由(2)的测定结果得到的温度‑荧光强度曲线进行一阶微分的步骤；在此，(i)荧光标记检测探针的碱基序列包含与目标碱基序列(A)互补的碱基序列(A')，(ii)竞争探针的碱基序列包含与碱基序列除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列(A)相同的非目标碱基序列(B)互补的碱基序列(B')，(iii)荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量以如下的条件决定：如果按照以下的步骤：(a)向含目标核酸、但实质上不含具有非目标碱基序列(B)的非目标核酸的对照目标核酸试样和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得对照目标反应试样和对照非目标反应试样的步骤，(b)改变各对照反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(c)对由测定结果得到的温度‑荧光强度曲线分别进行一阶微分的步骤操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.26 JP 2016-2099291.一种从核酸试样检测包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列(A)的方法，其中，该方法包括以下的步骤：(1)向核酸试样中加入用可用于QP(消光探针/引物，QuenchingProbe/Primer)法的荧光染料标记的检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列(A)的目标核酸杂交的步骤，(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(3)对由(2)的测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分的步骤；在此，(i)荧光标记检测探针的碱基序列包含与目标碱基序列(A)互补的碱基序列(A')，(ii)竞争探针的碱基序列包含与碱基序列除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列(A)相同的非目标碱基序列(B)互补的碱基序列(B')，(iii)荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量以如下的条件决定：如果按照以下的步骤：(a)向含目标核酸、但实质上不含具有非目标碱基序列(B)的非目标核酸的对照目标核酸试样和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得对照目标反应试样和对照非目标反应试样的步骤，(b)改变各对照反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及(c)对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线分别进行一阶微分的步骤操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。2.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括以下的步骤：(4)当(3)中得到的一阶微分曲线具有峰的情况下，判断为核酸试样中存在目标碱基序列(A)的步骤；在此，核酸试样除目标核酸以外还可包含非目标核酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少5℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值低。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值低。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的Tm值比荧光标记检测探针的Tm值高至少10℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：道行悟，神田秀俊，
申请(专利权)人：荣研化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP