一种检测探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测探针及其应用，所述探针包括标记有荧光素酶的探针A和标记有量子点的探针B；其中，所述探针A的一端与目标核酸的一端部分序列互补，所述探针B的一端与目标核酸的另一端部分序列互补，所述探针A的另一端与探针B的另一端存在部分互补的序列；所述探针A、探针B和目标核酸杂交形成稳定的T型结构，所述荧光素酶与量子点能相互配对发生生物发光共振能量转移；本发明专利技术通过设计特异性探针，巧妙地将探针与核酸形成稳定T结构，利用生物发光能量共振转移的原理，优化反应条件，能精准区分单碱基突变，有效检测目标核酸，操作简单，所需时间短，方便快捷，成本较低。

A Detection Probe and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测探针及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测探针及其应用。
技术介绍
生物发光共振能量转移(bioluminescenceresonanceenergytransfer,BRET)是一种发生在生物发光蛋白如荧光素酶(供体)和荧光物质(受体)间的非辐射能量转移。由于BRET不需外源激发、背景低、灵敏度高，已作为微小距离的光学尺在蛋白相互作用、活体影像、核酸分析、蛋白酶检测及高通量筛选等生物分析相关领域得到了广泛的应用。BRET技术是基于在某些海生动物体内(如海肾荧光素酶)共振能量转移现象并导致能量供体和能量受体之间非放射性的能量转移。BRET中能量供体是发光的荧光素酶，在相应底物存在时发射相应波长的光谱，能量的受体通常为荧光蛋白或者荧光材料(小分子染料或纳米材料)，只要在其可被激发光谱范围内吸收到能量，即可在长波长处发射光信号。BRET形成的关键之一，是供体发射光谱和受体吸收光谱必须重叠，能量转移才能发生。底物不同，可被激发的波长范围不同，所选的受体材料也需要相应调整。量子点(Quantumdot，QD)是一种半导体纳米材料，因其具有高量子产率,可调发射波长，发射峰窄适用于生物标记物的多组分荧光检测，可缩短分析所需的时间，节省检测试剂，降低分析成本，成为荧光生物传感器开发领域的重要前沿。QD可以用单一光源激发，区别于其他荧光染料(如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(Rhodamine))，大大的简化多色荧光检测对多种光源的依赖性。QD还可以完全不受制于外部激发光源。在此专利技术建立的检测模式中，QD以受体的身份从固定在其表面上的荧光素酶(供体)以振能量转移的方式得到能量而发光。生物发光与一般的荧光检测方法的重要的区别在于它不需要激发光源。它们的发光依赖于荧光素的氧化过程，生物发光能量以非辐射共振的方式转移到该量子点使其发光。荧光素酶在有氧气的环境下催化底物氧化，使其发光。荧光素酶可视为两部分相连的蛋白质片段组成。这两部分片段具有与完整的荧光素酶相同的发射光谱特性，但其各自的催化发光强度分别只有完整荧光素酶的1/50和1/100。此催化发光能力的差异是以荧光素酶片段互补来控制生物发光及在保持低背景辐射下向量子点能量转移的重要基础。目前检测微小RNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵分析和实时荧光定量聚合酶链式反应。Northern印迹分析是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于微小RNA分析的几种方法之一，这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。微点阵分析也是基于杂交的原理来检测微小RNA，它通过测定特定过程中微小RNA的表达水平，来分析了解微小RNA的表达调控机制以及由微小RNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。实时荧光定量聚合酶链式反应通过扩增技术，是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。CN105807064A提供了一种荧光素酶互补量子点生物传感器及其构建方法及其应用，所述荧光素酶互补量子点生物传感器包括量子点、荧光素酶氨基端片段、荧光素酶羧基端片段、可特异识别待测物的探针和可与所述荧光素酶发生生物发光反应的底物；该专利技术结合量子点传感器的光学优势，通过实现荧光素酶氨基端片段和羧基端片段在量子点表面的诱导互补，重建催化功能，构建得到新型高灵敏度生物传感器，可应用于多种生物标记物的高靶向检测，并适于在均相体系中对目标检测物的准确定量，但该方法步骤繁复，耗时长。综上所述，国民经济的高速发展极大提升了国民对健康的关注，为在获得高标准健康的同时实现健康的低成本，亟需开发基于生物发光共振能量转移的新型检测试剂盒及其检测方法，以实现高效检测核酸的目的。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种检测探针及其应用，本专利技术根据目标核酸设计分别带有荧光素酶和量子点的特异性的两条探针，巧妙地将探针与目标核酸形成T型结构，利用生物发光能量共振转移的原理，优化反应条件，精准高效检测目标核酸，节省时间和成本，具备重要的应用价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种检测探针，基于目标核酸设计而成，所述探针包括标记有荧光素酶的探针A和标记有量子点的探针B；其中，所述探针A的一端与目标核酸的一端部分序列互补，所述探针B的一端与目标核酸的另一端部分序列互补，所述探针A的另一端与探针B的另一端存在部分互补的序列；所述探针A、探针B和目标核酸杂交形成稳定的T型结构，所述荧光素酶与量子点能相互配对发生生物发光共振能量转移。本专利技术中，专利技术人在长期实验实践的过程中，充分理解生物发光能量共振转移的原理与优势，将其与PCR检测核酸的方法相结合，经过大量实验摸索探究及验证，巧妙地设计分别带有荧光素酶和量子点的两条特异性的探针，能与目标核酸杂交成稳定的T型结构，使得荧光素酶和量子点发生生物发光能量共振转移，优化反应条件，调整反应温度时间和浓度，精准高效检测核酸能够区分单碱基突变，节省时间，操作便捷。生物发光共振能量转移技术(BRET)是基于在某些海生动物体内(如海肾荧光素酶)共振能量转移现象并导致能量供体和能量受体之间非放射性的能量转移。BRET中能量供体是发光的荧光素酶，在相应底物存在时发射相应波长的光谱，能量的受体通常为荧光蛋白或者荧光材料(小分子染料或纳米材料)，只要在其可被激发光谱范围内吸收到能量，即可在长波长处发射光信号。BRET形成的关键之一，是供体发射光谱和受体吸收光谱必须重叠，能量转移才能发生。底物不同，可被激发的波长范围不同，所选的受体材料也需要相应调整。优选地，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、海萤荧光素酶或萤火虫荧光素酶中的任意一种，优选为Gaussia荧光素酶。优选地，所述荧光素酶的发射波长为400-600nm，例如可以是400nm、430nm、460nm、480nm、500nm、530nm或580nm，优选为450-550nm。Gaussia荧光素酶是最晚发现的荧光素酶，分子量为19.9kDa，是迄今发现的最小的荧光素酶(Fluc：62kDa；Rluc:36kDa)，比起萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶具有超高的发光效率(1000倍)、极高的热稳定性(95℃处理30分钟仍能保持65％的生物发光能力)。Gaussia荧光素酶在有氧气的环境下催化空腔素(Colenterazine)的氧化，生成其氧化产物及二氧化碳且发光，其发光波峰在480nm(400-600nm宽)，很适合与具有655nm发射波长的量子点组成BRET配对。优选地，所述量子点包括CdSe/ZnS量子点、CdTe量子点、CdTe/CdS量子点、CdTe/CdS/ZnS量子点、ZnTe量子点、InP/ZnS量子点或ZnSe量子点中的任意一种。优选地，所述量子点的发射波长为400-750nm，例如可以是400nm、43本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测探针，基于目标核酸设计而成，其特征在于，所述探针包括标记有荧光素酶的探针A和标记有量子点的探针B；其中，所述探针A的一端与目标核酸的一端部分序列互补，所述探针B的一端与目标核酸的另一端部分序列互补，所述探针A的另一端与探针B的另一端存在部分互补的序列；所述探针A、探针B和目标核酸杂交形成稳定的T型结构，所述荧光素酶与量子点能相互配对发生生物发光共振能量转移。

【技术特征摘要】
1.一种检测探针，基于目标核酸设计而成，其特征在于，所述探针包括标记有荧光素酶的探针A和标记有量子点的探针B；其中，所述探针A的一端与目标核酸的一端部分序列互补，所述探针B的一端与目标核酸的另一端部分序列互补，所述探针A的另一端与探针B的另一端存在部分互补的序列；所述探针A、探针B和目标核酸杂交形成稳定的T型结构，所述荧光素酶与量子点能相互配对发生生物发光共振能量转移。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、海萤荧光素酶或萤火虫荧光素酶中的任意一种，优选为Gaussia荧光素酶；优选地，所述荧光素酶的发射波长为400-600nm，优选为450-550nm；优选地，所述量子点包括CdSe/ZnS量子点、CdTe量子点、CdTe/CdS量子点、CdTe/CdS/ZnS量子点、ZnTe量子点、InP/ZnS量子点或ZnSe量子点中的任意一种；优选地，所述量子点的发射波长为400-750nm，优选为600-700nm；优选地，所述荧光素酶和量子点的距离为5-10nm。3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，所述荧光素酶经过SMCC活化与所述探针A的巯基端相连；优选地，所述量子点经过链霉亲和素修饰与所述探针B的生物素标记端相连。4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其特征在于，所述探针A与探针B的部分互补序列的长度为4-9个碱基，优选为5-8个碱基。5.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，罗擎颖，刘琳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44