包含瘦素的融合蛋白及其生产和使用方法技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白，包含瘦素和与第二种蛋白。第二种蛋白的存在可以增加体内的生物活性和/或延长半衰期。本发明专利技术还提供了与肽、抗体或抗体片段融合的人、犬、猫瘦素分子，增强了瘦素分子透过血脑屏障(BBB)运输的能力。本发明专利技术还进一步提供了一种融合蛋白，包含一种肽激动剂，该肽激动剂能够结合并刺激GLP‑1受体、胰高血糖素受体和GIP受体等三种受体中的一种、两种或者全部。本发明专利技术还公开了一种通过重组技术生产此类融合蛋白的方法。本发明专利技术还公开了一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的融合蛋白，以及使用该药物组合物治疗狗、猫和人疾病的方法。

Fusion protein containing leptin and its production and use

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含瘦素的融合蛋白及其生产和使用方法相关申请的交叉援引本申请要求2016年7月8日提交的编号为62/360,271的美国临时申请作为优先权，并将其全部内容援引于本申请中。
本专利技术涉及一种融合(即嵌合)蛋白，包含抗体或其片段和瘦素蛋白。本专利技术还涉及包含该融合蛋白的药物组合及其制备和使用方法。特别地，本专利技术涉及Fc区域和包含免疫球蛋白的瘦素(“瘦蛋白”)融合蛋白的制备和应用。
技术介绍
宠物的代谢紊乱与一些重要的生理紊乱有关，如糖尿病、高血压、心脏病和某些类型的癌症以及其他代谢紊乱相关的疾病。例如，仅在美国，据估计约有52.7％或约4380万只狗超重或肥胖，其中大约有17.6％或约1390万只狗被判定为肥胖。此外，在美国估计约有57.9％或约5500万只猫超重或肥胖，其中大约有28.1％或约2620万只猫被判定为肥胖。越来越多的迹象表明，在美国以及世界各地，肥胖已成为家庭伴侣动物的严重健康问题。肥胖是一种多因素表型，它可以是生理、心理、遗传和环境等多种因素共同作用的结果。与肥胖相关的一个特殊因素是肥胖(ob)基因，该基因已被成功克隆。在正常小鼠中，ob基因编码一种叫做瘦素的激素。瘦素通过与其受体结合发挥功能，该受体具有细胞质结构域，能够进行信号转导。通过受体-激素机制，脂肪组织向血液中释放瘦素来告知大脑能量储存的状态，瘦素在血液中穿过血脑屏障到达下丘脑的瘦素受体。当大脑接收能量存储信息后，通过减少食物摄入和/或增加能量消耗来进行相应地调整。病理状态(即病态的老鼠，ob/ob纯合子)即肥胖小鼠，具有两个突变的ob等位基因纯合子。突变等位基因产生缩短的瘦素，这类瘦素不具备功能，可能会在体内迅速降解。具有两个突变ob等位基因(ob/obMice)的小鼠，缺乏功能性瘦素，导致嗜睡、体温过低、高血糖、高胰岛素和不育。在人类中，虽然大多数肥胖患者报告有高水平的循环瘦素，但缺乏瘦素发挥功能的证据，并显示体重显著增加和出现肥胖相关性疾病。通常认为，重组瘦素可以缓解ob/ob小鼠由于缺乏瘦素所导致的代谢紊乱及相关的各种症状。例如，有研究表明，每天腹腔注射瘦素可以降低ob/ob小鼠的摄食量、体重、体脂率、血糖和胰岛素浓度。此外，服用瘦素还能提高代谢率、体温和运动能力，而这些都需要消耗能量。研究还表明，瘦素治疗可以降低体重、摄食量和体脂率。正常小鼠在瘦素治疗中也可获益。其他研究也表明，重组瘦素也可用于改善雌性和雄性ob/ob小鼠的不育症。据估计，大约5-10％的肥胖人群对瘦素治疗敏感。不幸的是，目前的瘦素治疗需要每天进行多次注射，且需要高剂量的瘦素才能达到预期的临床效果。例如，在最近的临床试验中，一些受试者需要每天注射三次高剂量的瘦素，持续给药六个月才能观察到药效。由于低剂量的瘦素相对无效和/或相对较短的血清半衰期，所以认为高剂量和较长的治疗时间是必需的，除此之外没有任何理论限制。因此，人们认为使用天然瘦素需要频繁地大剂量给药。这一发现也与ob/ob小鼠实验的观察结果一致，ob/ob小鼠需要在腹腔内注射5-20mg/kg/day的瘦素，经过较长时间的给药体重才会显著下降。在ob/ob小鼠中实现瘦素所需的血浆浓度以克服瘦素的这种缺点(即效力低和/或半衰期短)的一种方法，需要连续皮下注射400ng/hr的瘦素。同样，不受任何理论限制的是，瘦素的大小、制备方法等内在特征似乎是瘦素在肥胖治疗中应用不足的原因之一。例如，瘦素的分子量约为16kD，小到足以被肾脏过滤清除。为了弥补体内瘦素相对较短的血清半衰期，需要给予相对较大的剂量。此外，利用细菌制备较小的蛋白分子如瘦素，可能会较为困难和具有不确定性。在某些情况下，使用大肠杆菌生产小分子蛋白质如瘦素，可能会导致蛋白以不溶性包涵体的形式产生。为了从包涵体中获取蛋白，通常需要使用变性剂如盐酸胍，来溶解包涵体，从而导致目的蛋白遭到破坏。此外，纯化过程中可能会涉及变性条件。因此，利用细菌生产小的功能性蛋白往往需要在分离后的适当条件下进行“折叠”。此外，包括瘦素在内的一些蛋白含有分子内二硫键，这些键也必须重铸或重新形成。因此，利用细菌生产可溶性生物活性小分子有时需要对制备的蛋白进行再生、重折叠和/或形成分子内二硫键。由于这种生产过程较为复杂，如果有可能的话，利用原核生物生产瘦素等小功能蛋白往往是困难的。研究人员曾尝试通过提高瘦素的溶解度来提高其产量。例如，一种方法是用天冬氨酸或谷氨酸取代某些氨基酸残基，使瘦素等电点(pI)从5.84提高到5.5或更低。例如，参见美国专利，编号5,719,266。然而，由此产生的瘦素“衍生物”在受试者中可能具有免疫原性。由于治疗需求剂量大，生产效率低，血清半衰期短，纯化过程极其复杂，因此急需一种能够提高瘦素生产收率的方法。同时，也需要瘦素具备更好的药理学特征。目前，已知一种半衰期更长的犬类瘦素类似物，以聚乙二醇化修饰的形式存在(见PCT公开号WO2014/165189)，目前仍然需要活性更强、半衰期更长的瘦素类似物来治疗犬类的肥胖和相关代谢紊乱。专利技术概述本专利技术的某些方面，提供了一种融合蛋白和嵌合蛋白，其中包含一种瘦素，该瘦素改善了(i)体内的药理特性，(ii)体内半衰期，(iii)或以上两者。在某些实施方案中，包括瘦素的融合蛋白(即嵌合蛋白)提高了半衰期。本专利技术的一个具体方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含与第二种蛋白相连接的第一种蛋白。第一种蛋白可以通过接头连接到第二种蛋白，或者它们彼此也可以直接连接。示例性接头包括但不限于SEQIDNO：36-40。值得庆幸的是，任何合适的接头都可以使用，包括聚乙二醇(PEG)以及其他本领域内所熟知的氨基酸链。第一种蛋白包括(a)犬免疫球蛋白Fc(IgFc)区域；(b)犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQIDNO:25有至少75％序列同源性；(c)猫IgFc区；或(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQIDNO:26有至少75％序列同源性。根据第一种蛋白的特性，第二种蛋白可以是犬瘦素蛋白，也可以是猫瘦素蛋白。本专利技术的另一个方面，第一种蛋白质包括人源瘦素或其类似物，其氨基酸序列与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3有至少85％序列同源性；第二种蛋白包括从人IgG1Fc中选择的Fc片段(例如SEQIDNO：8)，从人IgG2Fc中选择的Fc片段(例如SEQIDNO：9)，以及从人IgG4Fc中选择的Fc片段(例如SEQIDNO：10)。本专利技术的另一个方面，提供了一种嵌合分子。所述嵌合分子包括(a)一种肽激动剂，选自GLP-1或其类似物、GIP或其类似物、艾塞那肽或其类似物、胃泌酸调节素或其类似物；(b)能够结合低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮受体的结合结构域；(c)瘦素或其类似物。本专利技术的一些具体融合蛋白包括(i)Fc-瘦素融合蛋白其氨基酸序列与SEQIDNO：41和SEQNO：47或二者的组合有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性；(ii)一种Fc-瘦素融合蛋白其氨基酸序列与SEQIDNO：42有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包括与第二种蛋白相连接的第一种蛋白，其中所述第一种蛋白包含：(a)犬免疫球蛋白Fc(“Ig Fc”)区；(b)犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：25至少有75％序列同源性；(c)猫Ig Fc区；或(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：26至少有75％序列同源性；当所述第一种蛋白是犬Ig Fc区或犬白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的犬瘦素蛋白至少有87％序列同源性；当所述第一种蛋白是猫Ig Fc区或猫白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的猫瘦素蛋白至少有87％序列同源性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.08 US 62/360,2711.一种融合蛋白，包括与第二种蛋白相连接的第一种蛋白，其中所述第一种蛋白包含：(a)犬免疫球蛋白Fc(“IgFc”)区；(b)犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQIDNO：25至少有75％序列同源性；(c)猫IgFc区；或(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQIDNO：26至少有75％序列同源性；当所述第一种蛋白是犬IgFc区或犬白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQIDNO：4或SEQIDNO：5所示的犬瘦素蛋白至少有87％序列同源性；当所述第一种蛋白是猫IgFc区或猫白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQIDNO：6或SEQIDNO：7所示的猫瘦素蛋白至少有87％序列同源性。2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一种蛋白通过蛋白质接头与所述第二种蛋白连接。3.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二种蛋白与所述第一种蛋白的C-末端连接。4.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述犬IgFc区包含的氨基酸序列与序列SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13或SEQIDNO：14至少有90％序列同源性。5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述犬IgFc区肽是犬IgGDFc区，其包含氨基酸序列与SEQIDNO：14至少有90％序列同源性，并且其中所述犬IgGDFc区包含SEQIDNO：14的ProAlaAla(S10P/L16A/L17A)突变体。6.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQIDNO：47、48或49至少有98％的序列同源性。7.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述猫IgFc区包含的氨基酸序列与SEQIDNO：15或SEQIDNO：16有至少95％序列同源性。8.权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含结合域，结合域为多肽、抗体、或抗体片段；所述结合域能够结合低密度脂蛋白受体-相关蛋白1(LPR1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮细胞受体，引起受体内吞或转胞吞作用，增加融合蛋白通过血脑屏障的递送。9.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述结合域是选自SEQIDNO：17和SEQIDNO：18的血管生成素-2多肽。10.权利要求9所述的融合蛋白，其中所述血管生成素-2多肽连接于所述融合蛋白的N-端。11.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述的结合域包含的氨基酸序列与SEQIDNO：19有至少95％序列同源性。12.权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含能够激活选自下组受体的肽激动剂：(a)GLP-1受体、b)胃抑制性多肽(GIP)受体、(c)胰高血糖素受体、和(d)其两种或多种的组合。13.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂通过连接器与所述融合蛋白连接。14.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂选自(i)GLP-1或其类似物、(ii)艾塞那肽或其类似物、(iii)GIP或其类似物、(iv)胃泌酸调节素或其类似物。15.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂与所述融合蛋白的N-末端连接。16.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂包含的氨基酸序列选自SEQIDNO：28-35。17.一种融合蛋白，包括与第二种蛋白相连接的第一种蛋白；第一种蛋白是人瘦素或其类似物，与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3有至少85％序列同源性；第二种蛋白的Fc片段选自人IgG1Fc，人IgG2Fc和人IgG4...

【专利技术属性】
技术研发人员：越峰·吕，卢建丰，杨岚，李路，K·肖恩贝克，刘磊，
申请(专利权)人：奥美药业有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US