一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述工程菌可分泌高活性重组精氨酸脱羧酶，并且该工程菌可应用于中试高密度发酵培养，使重组精氨酸脱羧酶工业化生产成为可能。本发明专利技术发酵培养方法通过对发酵培养基的筛选及发酵诱导培养条件的优化，通过控制甘油、氨水的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速，通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目标蛋白酶大量表达。

A Genetically Engineered Arginine Decarboxylase Strain and Its High Density Fermentation Culture Method

【技术实现步骤摘要】
一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。
技术介绍
精氨酸脱羧酶(Argininedecarboxylase,ADC)，是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖型脱羧酶，以L-精氨酸为底物，脱去羧基后生成胍基丁胺(见图1)。胍基丁胺作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值，而目前企业主要采用化学法生产胍丁胺，生产过程复杂，对环境污染严重。生物酶法具有环保、高效等特点，如何采用精氨酸脱羧酶大规模生产胍基丁胺，是人们研究的热点。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)体内存在两种精氨酸脱羧酶基因，一种编码基因为adiA；另一种编码基因为speA。中国专利申请(CN105062943A)公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，所述重组菌以E.coliBL21(DE3)为宿主、pET20b(+)为表达载体，表达来源于E.coliBL21的精氨酸脱羧酶基因speA。利用所述重组菌生产精氨酸脱羧酶的方法，是将重组菌种子液接种至发酵培养基(SOC培养基)，培养至OD600为0.7，然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，所得精氨酸脱羧酶的比酶活可达0.53U/mg。王鹏根据NCBI发表的E.coliMG1655中精氨酸脱羧酶基因adiA序列和pET-28a载体多克隆位点构建得到精氨酸脱羧酶基因工程菌(王鹏.氨基酸脱羧酶重组表达及应用研究[D].南京大学,2015.)。中国专利申请(CN105861529A)将来源于腐败西瓦氏菌的精氨酸脱羧酶在大肠杆菌内表达，产生的精氨酸脱羧酶用于转化L-精氨酸生产胍基丁胺，产量为61～71g/L，转化率为68～82％。综合现有技术报道并结合实际生产经验，专利技术人发现以不同来源的编码精氨酸脱羧酶的基因构建基因工程菌，所得重组精氨酸脱羧酶的酶活及转化能力存在明显不同，且现有技术中的培养方法所得到的发酵液中菌体浓度不高，进而导致精氨酸脱羧酶表达量不高。目前几乎未见将所得重组菌用于高密度发酵生产精氨酸脱羧酶的报道。此外，不同发酵培养基，不同诱导培养方式以及不同的发酵调控方式也会影响基因工程菌的发酵生产能力。因此开发一种高效的精氨酸脱羧酶的生产方法对精氨酸脱羧酶的产业化应用有重要的实践意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是实现高活性重组精氨酸脱羧酶的高密度发酵培养。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术目的之一，提供一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，重组表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术目的之二，提供以上所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的高密度发酵培养方法，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量等。碳源为甘油或葡萄糖，氮源为氨水、蛋白胨或酵母粉；优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。本专利技术目的之三，提供利用以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶。本专利技术目的之四，提供以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶在制备胍基丁胺中的应用。在发酵工业中，工程菌往往由于表达载体、表达宿主、表达条件等，使菌体高密度生长和重组蛋白的高水平表达受限，从而致使工程菌无法真正适用于工业化生产中。本专利技术以核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的adiA基因为目的基因，以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，利用基因工程手段，构建得到的工程菌性能稳定，可分泌高活性重组精氨酸脱羧酶，并且该工程菌可应用于规模化高密度发酵生产。本专利技术所述工程菌的发酵培养方法，通过对发酵培养基的筛选及诱导培养条件的优化，通过控制甘油、氨水的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速、通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目的蛋白酶大量表达。本专利技术方法在短时间内(24～30h)不仅实现了工程菌高密度培养，菌体湿重可以达到100g/L以上，而且得到高催化活性的发酵液，所得重组精氨酸脱羧酶酶活可以达到5000U/mL以上，大大增加了单位发酵液的细胞酶量。本专利技术方法有利于降低发酵成本，使得生物反应体系得到高效利用，提高生物质资源的利用率。附图说明图1：精氨酸脱羧酶催化反应示意图图2：实施例2中不同培养基组成对酶活的影响图3：实施例2中装液量对菌体生长和酶活的影响图4：实施例2中接种量对酶活的影响图5：实施例2中诱导温度对菌体生长和酶活的影响图6：实施例2中诱导时间对菌体生长和酶活的影响图7：实施例2中诱导剂浓度对菌体生长和酶活的影响图8：实施例2中30℃诱导培养酶活液相检测图谱图9：实施例4中中试发酵甘油、氨水流加速率曲线图谱图10：实施例4中中试发酵菌体生长及比生长速率曲线图谱图11：实施例4中中试发酵酶活变化曲线图12：实施例4中中试发酵过程控制参数变化曲线图13：精氨酸脱羧酶发酵技术路线具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。针对
技术介绍
中所涉及的问题，本专利技术第一个方面，提供一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述adiA基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术构建所得基因工程菌可应用于中试发酵中，分泌高活性精氨酸脱羧酶。本专利技术第二个方面，提供一种以上所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量；碳源为甘油或葡萄糖，氮源为氨水、蛋白胨或酵母粉；优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。进一步地，所述发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na2HPO4·12H2O6～50g/L，K2HPO4·3H2O3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，余量为水。本专利技术通过对不同营养成分的筛选，所得上述发酵培养基效果最佳。进一步地，发酵诱导培养过程中，诱导剂为IPTG或乳糖；优选的，诱导剂为IPTG，IPTG诱导浓度为0.3～0.6mmol/L，诱导时间为5～8h。在该诱导条件下，所得重组酶活力最好。进一步地，在发酵过程中，待发酵至溶氧开始回升时流加甘油，所用甘油浓度为40～60％，流加速率为0.2～30mL/(L·h)，流加甘油总量为发酵培养基体积的10～30％。进一步地，在发酵2～6h开始流加氨水，所用氨水浓度为10～30％，流加速率为0.1～5mL/(L·h)，流加氨水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E.ColiK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E.ColiK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的高密度发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量；碳源为甘油或葡萄糖，优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na2HPO4·12H2O6～50g/L，K2HPO4·3H2O3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，余量为水。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵诱导培养过程中，诱导剂为IPTG或...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建国，张言慧，高先岭，
申请(专利权)人：山东国力生物科技有限公司，山东国力生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37