一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。本发明专利技术所述方法对Listeria monocytogenes来源gshF基因序列进行优化后得到SEQ ID NO.1所示碱基序列，以此为模板构建工程菌；通过对发酵培养基的优化，最终获得了高活性的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶。本发明专利技术所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高。酶催化生产谷胱甘肽效率高。酶催化生产谷胱甘肽效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一种含有γ
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酰胺键和巯基的三肽化合物，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸这三种氨基酸通过肽键缩合而成，化学名为γ
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L
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谷氨酰
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L
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半胱氨酸
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甘氨酸。谷胱甘肽有还原型和氧化型两种类型，谷胱甘肽的主要活性成分是还原型谷胱甘肽。谷胱甘肽具有解毒、抗氧化、抗惊厥、抗血栓和抗动脉粥样硬化作用。由于谷胱甘肽在众多领域的运用，并且目前大多数的谷胱甘肽的原料药都依赖于进口，大大增加了谷胱甘肽的用药成本和研发经费，所以谷胱甘肽的制备备受国人的关注。谷胱甘肽的制备方法主要有溶剂提取法、发酵法、化学合成法和酶合成法。化学合成法制备GSH，是将L
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Glu、L
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Cys和Gly经过基团保护、缩合以及脱保护三阶段的一系列化学反应合成GSH，是谷胱甘肽早期的生产方法，生产工艺也较为成熟。但这种方法存在很多缺陷，例如反应步骤繁多，反应时间长，操作过程难度大，产生需要光学拆分的消旋体使得不易分离，谷胱甘肽纯度不高以及对环境会造成污染等。溶剂提取法主要是通过萃取和沉淀相结合的方法，从富含GSH的动植物、酵母等生物组织中提取产物，先使用适当的溶剂或者结合蛋白酶、淀粉酶处理，再进行分离和精制得到最终产物。萃取法的原料以酵母居多，一般使用的都是未经选育和遗传性改造的，因此本身产品含量就低，再通过复杂的工艺流程处理后，总收率很低，致使该方法的成本高，可推广性较差。
[0003]专利CN109593735A采用重组菌表达一种双功能谷胱甘肽合成酶，但该酶来自于蜡状芽孢杆菌，并且该专利为加入0.5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，不仅增加了纯化负担，也不利于谷胱甘肽及ATP分子透过细胞膜壁。
[0004]李斯特菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶由两个功能性蛋白结构域组成，催化GSH合成的两步反应，见下式。
[0005][0006]Streptococcus pasteurianus、Streptococcus infantarius、Streptococcus agalactiae及Streptococcus thermophilus这4种不同菌种来源的双功能酶氨基酸序列相似度达79％，因为它们均为革兰氏阳性菌，同属于链球菌属。Actinobacillus pleuropneumoniae、Pasteurella multocida及Haemophilus parainfluenzae来源的双功能酶氨基酸序列同源性高于80％，可能是因为它们都为革兰氏阴性菌，属于γ
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变形菌门。李斯特菌来源的GSH F与其它几株含有双功能酶的菌株同源关系较远，属于厚壁菌门。不同菌种来源的GSH F系统发育树见图1。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要目的是提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的
方法。本专利技术所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高，适用于GSH的大规模生产。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面，提供一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0010]工程菌的构建：编码谷胱甘肽合成酶的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达载体为pET
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28a(+)，宿主菌为：Escherichia coli BL21(DE3)。
[0011]将所述工程菌进行种子培养；
[0012]将所述工程菌进行发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中，设定初始培养温度为30
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37℃，待菌体生长至对数生长中期后加入诱导剂进行诱导，并调节温度≤30℃；
[0013]所述发酵培养基包括：甘油10
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20g/L、蛋白胨8
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15g/L、酵母粉5
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15g/L、玉米浆5
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20g/L、磷酸氢二钠10
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20g/L、磷酸二氢钾1
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10g/L、氯化铵1
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5g/L、硫酸镁0.5
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5g/L。
[0014]进一步地，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉12g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁2g/L，溶剂为水。
[0015]进一步地，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油20g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为水。
[0016]进一步地，当所用发酵培养基体积≥5L时，流加碳源与氮源以控制溶氧在临界氧浓度以上。
[0017]进一步地，采用氨水控制发酵液pH在6.5
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8.5。
[0018]进一步地，设置初始搅拌转速为100
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200r/min，当发酵液溶氧≤20％时，增加搅拌转速使溶氧维持在20％以上
[0019]本专利技术第二方面提供一种催化生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：采用以上第一方面所述方法制备谷胱甘肽合成酶，收集发酵后的菌体；将菌体悬浮后进行高压均质破壁，将均质后的菌液加入到转化体系中进行转化。
[0020]进一步地，在500
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1000bar压力下进行至少2次高压均质破壁。
[0021]进一步地，所述转化体系为：L
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谷氨酸1
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10g/L，L
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半胱氨酸1
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5g/L，L
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甘氨酸0.5
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5g/L，MgSO47H2O 10mmol/L和ATP 10
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40mmol/L。
[0022]进一步地，转化时温度为30
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40℃，体系pH值控制在7.0
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9.0。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：
[0024]本专利技术所述方法对Listeria monocytogenes来源gshF基因序列进行优化后得到SEQ ID NO.1所示碱基序列，以此为模板构建工程菌；通过对发酵培养基的优化，最终获得了高活性的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶。本专利技术所述方法制备得到的Listeria monocytogenes来源的谷胱甘肽合成酶催化生产谷胱甘肽效率高。
[0025]采用本专利技术所述发酵培养基在发酵罐中大量生产时，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：工程菌的构建：编码谷胱甘肽合成酶的和核酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，表达载体为pET
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28a(+)，宿主菌为：Escherichia coli BL21(DE3)；将所述工程菌进行种子培养；将所述工程菌进行发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中，设定初始培养温度为30
‑
37℃，待菌体生长至对数生长中期后加入诱导剂进行诱导，并调节温度≤30℃；所述发酵培养基包括：甘油10
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20g/L、蛋白胨8
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15g/L、酵母粉5
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15g/L、玉米浆5
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20g/L、磷酸氢二钠10
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20g/L、磷酸二氢钾1
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10g/L、氯化铵1
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5g/L、硫酸镁0.5
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5g/L。2.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油10g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉12g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁2g/L，溶剂为水。3.根据权利要求1所述谷胱甘肽合成酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下成分组成：甘油20g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钠12g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化铵5g/L、硫酸镁...

【专利技术属性】
技术研发人员：张言慧，袁建国，
申请(专利权)人：山东国力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：