抗MRJP4的配对单克隆抗体、检测MRJP4的ELISA试剂盒和胶体金免疫试纸制造技术

本发明专利技术公开了抗MRJP4的配对单克隆抗体、检测MRJP4的ELISA试剂盒及胶体金免疫试纸。本发明专利技术以MRJP4重组蛋白为抗原采用细胞融合得到阳性细胞株，通过与其它蜂王浆主蛋白交叉反应检测获得MRJP4特异性融合细胞株，根据抗原表位配对检测进行配对初筛，根据配对结果、抗体表位检测和标准曲线绘制及样本测定等，最终确定了有较好线性关系且灵敏度高的抗MRJP4的配对单克隆抗体6H9和8C9。本发明专利技术分别构建了检测MRJP4的ELISA检测试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。本发明专利技术试剂盒特异性强，检测范围为1.563‑100ng/mL，检测灵敏度为3.758ng/mL，批内批间CV值小于10％。

Matched monoclonal antibodies against MRJP4, ELISA kit for detection of MRJP4 and colloidal gold immunoassay paper

【技术实现步骤摘要】
抗MRJP4的配对单克隆抗体、检测MRJP4的ELISA试剂盒和胶体金免疫试纸
本专利技术涉及蜂王浆主蛋白4(MRJP4)单克隆抗体的制备及其应用，尤其涉及配对的MRJP4单克隆抗体的制备，本专利技术进一步涉及用所制备的配对的MRJP4单克隆抗体构建的检测MRJP4的ELISA检测试剂盒和胶体金免疫检测试纸及其在定量或定性检测MRJP4中的应用，属于MRJP4的定性和定量检测领域。
技术介绍
蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆成分复杂，营养丰富，其中蛋白质含量为12.0％～15.0％。由于蜂王浆不易保存，极易变质。因而，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。目前，国际上缺少一个公认的，可以广泛推广、能如实反映蜂王浆新鲜度的方法，着也是现行蜂王浆质量标准的一个缺陷。中国是世界蜂王浆的第一生产国和第一出口国。因此，探求和建立蜂王浆新鲜度评价方法势在必行。研究表明，蜂王浆主蛋白与蜂王浆的新鲜度呈正相关，即蜂王浆越新鲜其王浆主蛋白含量越高。MRJP4对温度非常敏感，在冷藏或室温包藏条件下，随时间的延长其浓度逐渐降低。利用MRJP4抗原进行细胞融合方法筛选出特异性好、灵敏度高的配对的抗体对，进一步利用该配对的单克隆抗体构建出ELISA试剂盒和胶体金免疫检测试纸。ELISA检测试剂盒能实现对MRJP4绝对定量，胶体金免疫检测试纸则能在数分钟内对MRJP4蛋白实现现场快速检测，这将为蜂王浆新鲜度检测提供可靠和可实际应用的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供针对MRJP4蛋白的特异性好、灵敏度高的MRJP4单克隆抗体对；本专利技术的目的之二是将所制备的一对MRJP4单克隆抗体应用于MRJP4的定性或定量检测；本专利技术的目的之三提供一种定量检测检测样品中MRJP4含量的ELISA试剂盒；本专利技术的目的之四提供一种定性检测样品中是否含有MRJP4的胶体金免疫检测试纸。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术将MRJP4的全序列经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定SEQIDNo.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。本专利技术进一步将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合共12板，一共获得阳性细胞株64株；挑选其中的20株进行一亚，一亚检测后筛选出14株二亚，再经过三轮的亚克隆；经过与其它蜂王浆主蛋白的重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得9株MRJP4特异性融合细胞株，挑选了其中亲和力最高的5株进行后续抗体表位检测和配对实验，根据抗原表位配对检测进行下一步的配对初筛，最终根据抗体表位检测和配对、标准曲线绘制及样本测定结果发现，6H92B8(以下简称为6H9)和8C93B10(以下简称为8C9)这对配对的抗体有较好的线性关系且灵敏度高，故最终确定6H9和8C9用于构建检测MRJP4的ELISA试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。本专利技术将分泌6H9和8C9的杂交瘤细胞系分别提交提交专利认可的机构进行保藏；其中，分泌单克隆抗体6H9的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCCNo.17294；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月18日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分泌单克隆抗体8C9的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCCNo.17295；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年2月18日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术进一步提供了一种采用ELISA法定量检测MRJP4的酶联免疫试剂盒，包括：抗MRJP4的一抗，生物素标记的抗MRJP4的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其中，所述的一抗是抗MRJP4的单克隆抗体6H9，所述的二抗是抗MRJP4的单克隆抗体8C9；或者，所述的一抗是抗MRJP4的单克隆抗体8C9，所述的二抗是抗MRJP4的单克隆抗体6H9。本专利技术试剂盒检测MRJP4含量的工作原理或使用方法如下：用纯化的抗体包被微孔板制成固相载体，向包被抗MRJP4抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MRJP4抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的MRJP4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。应用本专利技术酶联免疫试剂盒采用双抗体加心ELISA法定量测定样本中MRJP4含量的结果表明，其检测范围为1.563ng/mL-100ng/mL，检测灵敏度为3.758ng/mL。本专利技术进一步提供了一种快速定性检测MRJP4的胶体金免疫检测试纸，包括：金标垫，含有检测线和质控线的NC膜，样本垫，吸水垫和检测底板；其中，所述的金标垫含有单克隆抗体6H9或8C9与胶体金的结合物；所述的NC膜含有一条检测线和一条质控线；所述的检测线由单克隆抗体6H9或8C9组成，所述的质控线由羊抗鼠IgG抗体组成。所述的金标垫以及含有检测线和质控线的NC膜可以按照胶体金免疫试剂盒的常规制备方法制备得到。作为参考，本专利技术提供一种金标垫的制备方法，包括：(1)将胶体金溶液与单克隆抗体6H9或8C9结合得到胶体金－抗体结合物原液；(2)将胶体金－抗体结合物溶液稀释后均匀加在玻璃纤维膜上，烤干，即得金标垫。本专利技术进一步对金标垫以及含有检测线和质控线的NC膜的制备方法中的各项参数进行了优化，通过优化试验发现，采用下述制备方法能够有效的提升检测效果：本专利技术通过胶体金梯度法试验发现，单克隆抗体6H9或8C9与胶体金溶液在pH值为7.4时进行结合，具有最优的结合效果。本专利技术通过蛋白梯度法试验发现，单克隆抗体6H9或8C9稳定1mL胶体金所需的最小抗体量为10μg/mL。经试验测试结果显示，当胶体金－抗体结合物原液的工作浓度为1:4时，制得的金标垫检测效果最佳。其中，在制备含有检测线(T线)和质控线(C线)的NC膜本专利技术进一步对NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度进行试验，结果表明，检测显色效果最优的一组浓度为：单克隆抗体6H9或8C9在T线上的最佳工作浓度为2mg/mL，羊抗鼠IgG抗体(C线上)的最佳工作浓度为1mg/mL。本专利技术进一步提供了一种应用本专利技术胶体金免疫检测试纸定性检测样品中是否含有MRJP4的方法，包括：(1)将样品加到试剂盒样本垫的加样孔中；(2)若样本为阳性，加样后在T区出现一条紫红色条带；若样本为阴性，则T区不会出现紫红色条带；无论样本中是否有MRJP4蛋白存在，C区都会出现一条紫红色条带。本专利技术提供的检测MRJP4的胶体金免疫检测试纸具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样本检测。应用本专利技术酶联免疫检测试剂盒定量测定样本中MRJP4含量的结果表明，本专利技术酶联免疫检测试剂盒的检测范围为1.563ng/mL-100ng/mL，检测灵敏度为3.758ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株稳定分泌抗MRJP4单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H9，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.17294。

【技术特征摘要】
1.一株稳定分泌抗MRJP4单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H9，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.17294。2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株6H9分泌的抗MRJP4单克隆抗体。3.一株稳定分泌抗MRJP4单克隆抗体的杂交瘤细胞株8C9，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.17295。4.由权利要求3所述杂交瘤细胞株8C9分泌的抗MRJP4单克隆抗体。5.权利要求2或4所述的抗MRJP4单克隆抗体在定性检测样品中是否含有MRJP4或定量检测样品中MRJP4含量的用途。6.一种检测MRJP4含量的酶联免疫试剂盒，包括：抗MRJP4的一抗，生物素标记的抗MRJP4的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其特征在于：所述的一抗是权利要求2所述的抗MRJP4单克隆抗体，所述的二抗是权利要求4所述的抗MRJP4单克隆抗体；或者所述的一抗是权利要求4所述的抗MRJP4单克隆抗体，所述的二抗是权利要求2所述的抗MRJP4单克隆抗体。7.一种检测MRJP4的胶体金免疫检测试纸，包括：金标垫，含有检测线和质控线的NC膜，样本垫，吸水垫和检测底板；其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡菡，魏俏红，陈思，冯毛，孟丽峰，韩宾，房宇，马川，李建科，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11