一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物化学技术领域，公开了一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用，所述提取方法包括预处理、超声处理+热水浸提、浓缩醇沉、洗涤纯化、透析冻干等步骤，通过单因素实验结合正交实验法对青鳞鱼糖蛋白的提取工艺进行了对比优化，得到青鳞鱼糖蛋白最佳提取工艺参数，本发明专利技术的青鳞鱼糖蛋白的提取方法具有设计合理、工艺简单、操作方便，产品提取率高、纯度高，无需大量使用有毒溶剂，产品安全性好，制备成本低，易于推广应用等优点；本发明专利技术还通过细胞实验验证说明了青鳞鱼糖蛋白在细胞免疫调节方面具有显著作用，为青鳞鱼糖蛋白应用于药品、食品的研发提供了参考依据。

Extraction and Application of Glycoprotein from Green Scale Fish

【技术实现步骤摘要】
一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用
本专利技术涉及生物化学
，更具体的，涉及一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用。
技术介绍
糖蛋白是寡糖链与多肽以多种形式共价相连且具有生物活性的物质，糖蛋白为生物体内重要生物大分子之一，广泛存在于动植物和微生物中，甚至在单细胞有机体和病毒中也有发现，其以各种形式、种类分布于生物体的细胞内外液及组织中，构成生物体内的多种活性物质。天然糖蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等生理活性。糖蛋白对于生长发育、信息传递、免疫系统、神经系统等多种生命活动起重要作用，同时与多种疾病(如心血管疾病、肝肾病、糖尿病及肿瘤癌症等)的发生、发展相关。随着科学技术的发展和国内外研究学者对海洋资源开发利用的重视，源于海洋动物的糖蛋白研究逐渐成为热点，吸引着许多学科如化学、生物学、生物化学、免疫学、细胞生物学、医药学以及食品科学的工作者从事这一领域的深入研究。青鳞鱼，又称青皮、青板玉、青鳞、柳叶青等，为鲱科动物，分布于我国渤海、黄海、东海和南海，青鳞鱼含有丰富的蛋白质和人体必需的氨基酸、维生素以及钙、铁、磷等矿质元素，是一种营养丰富、具有多种生理功能和开发潜力的鱼类。青鳞鱼用途广泛，还可入药，具有解毒消肿之功效，主治海蛇咬伤，对缓解呼吸困难、紫疳、牙关紧闭、抽风等中毒症状有特效。但至今未见有关于青鳞鱼糖蛋白提取方法以及其对免疫系统调节作用的研究和报道。综上所述，研发一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用实为必要。
技术实现思路
为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷(不足)，本专利技术提供一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用，本专利技术的青鳞鱼糖蛋白的提取方法具有设计合理、工艺简单、操作方便，产品提取率高、纯度高、性质稳定，无需大量使用有毒溶剂，制备成本低，易于推广应用等优点。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法，包括以下步骤：①预处理：将新鲜青鳞鱼去鳞洗净，沥干水分，取鱼肉切块，并置于绞肉机中绞碎，得到青鳞鱼肉泥，称重；②超声处理+热水浸提：将步骤①得到的青鳞鱼肉泥与蒸馏水按1:20-40(g/mL)的料液比混合均匀，超声处理20-40min，得到青鳞鱼混合物置入水浴锅，80-100℃条件下热水浸提2-4h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣与蒸馏水按1:20-40(g/mL)的料液比混合后超声处理20-40min，再于80-100℃热水浸提1h，过滤，合并两次的滤液，得到青鳞鱼糖蛋白混合溶液；③浓缩醇沉：将步骤②得到的混合溶液加入旋转蒸发器，50-70℃蒸发浓缩至原体积的1/5，在浓缩液中加入3倍体积量的无水乙醇，4℃条件下静置12-18h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，上清液每次醇沉时加入的无水乙醇量为其3倍体积量，醇沉后合并沉淀物；④除游离蛋白：将步骤③得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇和丙酮的用量以浸没沉淀物为准，洗涤后用蒸馏水将沉淀物完全溶解，所得溶液采用Sevage法去除游离蛋白得到青鳞鱼糖蛋白溶液；⑤透析冻干：对步骤④得到的青鳞鱼糖蛋白溶液装入透析袋，置于蒸馏水中，4℃下透析48h，将透析截留物冷冻干燥，即得青鳞鱼糖蛋白粉末，称重。进一步的，所述步骤④中，采用Sevage法去除游离蛋白的具体步骤为：在沉淀物溶解所得溶液中加入Sevage试剂，4℃条件下，置于磁力搅拌器中振荡1h，再置于离心机中，以12000r/min的转速离心15-20min，离心后溶液从上到下依次为水层、蛋白层、有机层，利用移液管将上层溶液吸出，重复上述步骤，直至离心后溶液不再出现蛋白层时，即可认为溶液中的蛋白质已基本除尽，收集上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，得到青鳞鱼糖蛋白溶液；其中，所述Sevage试剂的用量为所述沉淀物溶液的1/4体积量，所述Sevage试剂由正丁醇与氯仿按1:4的比例混合而成。进一步的，所述步骤②中，所述超声处理的条件为：温度25-30℃，超声功率为40W，超声处理的时间均为30min，超声处理采用的设备为超声波清洗机。进一步的，所述步骤②中，青鳞鱼混合物和滤渣热水浸提过程中，提取的料液比均为1:20(g/mL)，热水浸提的温度均为100℃。进一步的，所述步骤③中，对上清液重复进行醇沉操作时，每次加入的无水乙醇量相当于上清液体积的3倍体积量。进一步的，所述步骤⑤中，所用透析袋的截留分子量为5kDa，透析过程中每6小时更换一次透析液。本专利技术的青鳞鱼糖蛋白提取率＝步骤⑤所得青鳞鱼糖蛋白粉末重量/步骤①所得青鳞鱼肉泥重量*100％。本专利技术还公开了一种如上述提取方法制备得到的青鳞鱼糖蛋白在细胞免疫调节中的应用，通过实验证明青鳞鱼糖蛋白对小鼠来源单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)的增殖、吞噬能力以及细胞分泌NO、IL-6和TNF-α量的影响，从而说明青鳞鱼糖蛋白具有细胞免疫调节作用。与现有技术相比，本专利技术技术方案的有益效果是：本专利技术的青鳞鱼糖蛋白提取方法中，超声处理是利用超声波的强空化作用、强振动及高加速度的特性，加快青鳞鱼糖蛋白的溶出，从而提高糖蛋白提取率；采用热水浸提的方式提取青鳞鱼糖蛋白，工艺简单，操作方便，无需使用有毒溶剂，安全性高；浓缩后采用乙醇对糖蛋白溶液进行醇沉，可以将不同分子量阶段的糖蛋白进行收集提取，保证了制取糖蛋白种类的完整性，同时提高制备效率，无毒无害；采用Sevage法有效脱除游离蛋白，避免游离蛋白对产品提取率和纯度的干扰，提高产品的纯度；再采用透析法去除产品中的盐分及小分子杂质，确保产品纯度，透析截留物进行冷冻干燥，既可防止蛋白质变性，又能保持蛋白质中的固有成分，最终得到的糖蛋白具有疏松、溶解度好、结构稳定等优点。总之，本专利技术的青鳞鱼糖蛋白的提取方法设计合理、工艺简单、操作方便可行，粗产品易于分离提纯，产品提取率高、纯度高；提取过程中无需大量使用有毒溶剂，产品安全性好；制备条件温和，所得青鳞鱼糖蛋白结构稳定，同时也确保了糖蛋白的活性；提取方法中所使用的仪器试剂简单易得，因此制备成本低，且本专利技术的提取方法具有良好的重复再现性，易于推广应用。附图说明图1为超声时间对青鳞鱼糖蛋白提取率的影响；图2为提取时间对青鳞鱼糖蛋白提取率的影响；图3为提取温度对青鳞鱼糖蛋白提取率的影响；图4为料液比对青鳞鱼糖蛋白提取率的影响；图5为苯酚-硫酸法测定糖含量标准曲线及回归方程；图6为青鳞鱼糖蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响；图7为青鳞鱼糖蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响；图8为青鳞鱼糖蛋白对RAW264.7细胞分泌NO的影响；图9为青鳞鱼糖蛋白对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响；图10为青鳞鱼糖蛋白对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响。具体实施例下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术，以下实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受下述实施例的限制，因此本专利技术要求保护的范围并不局限于所述。实施例1：一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法，包括以下步骤：①预处理：将新鲜青鳞鱼去鳞洗净，沥干水分，取鱼肉切块，并置于绞肉机中绞碎，得到青鳞鱼肉泥，称重；②超声处理+热水浸提：将步骤①得到的青鳞鱼肉泥与蒸馏水按1:20(g/mL)的料液比混合均匀，超声处理30min，得到青鳞鱼混合物置入水浴锅，100℃条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：①预处理：将新鲜青鳞鱼去鳞洗净，沥干水分，取鱼肉切块并绞碎，得到青鳞鱼肉泥；②超声处理+热水浸提：将步骤①得到的青鳞鱼肉泥与蒸馏水按1:20‑40(g/mL)的料液比混合均匀，超声处理20‑40min，得到青鳞鱼混合物置入水浴锅，80‑100℃条件下热水浸提2‑4h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣重复超声处理和热水浸提进行提取，然后过滤，合并两次的滤液，得到青鳞鱼糖蛋白混合溶液；③浓缩醇沉：将步骤②得到的混合溶液加入旋转蒸发器，50‑70℃蒸发浓缩至原体积的1/5，所得浓缩液中加入3倍体积量的无水乙醇，4℃条件下静置12‑18h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，合并沉淀物；④除游离蛋白：将步骤③得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，再用蒸馏水将沉淀物溶解，所得溶液采用Sevage法去除游离蛋白，得到青鳞鱼糖蛋白溶液；⑤透析冻干：对步骤④得到的青鳞鱼糖蛋白溶液装入透析袋，置于蒸馏水中，透析48h，将透析截留物冷冻干燥，即得青鳞鱼糖蛋白粉末。

【技术特征摘要】
1.一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：①预处理：将新鲜青鳞鱼去鳞洗净，沥干水分，取鱼肉切块并绞碎，得到青鳞鱼肉泥；②超声处理+热水浸提：将步骤①得到的青鳞鱼肉泥与蒸馏水按1:20-40(g/mL)的料液比混合均匀，超声处理20-40min，得到青鳞鱼混合物置入水浴锅，80-100℃条件下热水浸提2-4h，过滤，所得滤液备用，所得滤渣重复超声处理和热水浸提进行提取，然后过滤，合并两次的滤液，得到青鳞鱼糖蛋白混合溶液；③浓缩醇沉：将步骤②得到的混合溶液加入旋转蒸发器，50-70℃蒸发浓缩至原体积的1/5，所得浓缩液中加入3倍体积量的无水乙醇，4℃条件下静置12-18h，进行醇沉，将醇沉物离心后收集沉淀物，再对上清液重复醇沉操作至无沉淀析出，合并沉淀物；④除游离蛋白：将步骤③得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，再用蒸馏水将沉淀物溶解，所得溶液采用Sevage法去除游离蛋白，得到青鳞鱼糖蛋白溶液；⑤透析冻干：对步骤④得到的青鳞鱼糖蛋白溶液装入透析袋，置于蒸馏水中，透析48h，将透析截留物冷冻干燥，即得青鳞鱼糖蛋白粉末。2.根据权利要求1所述的青鳞鱼糖蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤④中，采用Sevage法去除游离蛋白的具体步骤为：在沉淀物溶解所得溶液中加入Sevage试剂，在4℃条件下，振荡1h，然后以12000r/min的转速离心15-20min，收集上清液，重复该步骤至没有蛋白层析出。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄日明，韩玉，郝慧丽，杨丽红，孙远明，李向梅，李美英，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44