植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达重组人粒细胞集落刺激因子。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白杂交法确定重组人粒细胞集落刺激因子成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出重组人粒细胞集落刺激因子。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的重组人粒细胞集落刺激因子活性显著。

Application of Plant as Host in Expressing Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，主要由内毒素、TNF-a和IFN-r可活化单核细胞和巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞集嗜酸性细胞的多种功能。粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，G-CSF)基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，人G-CSF基因位于17号染色体，与小鼠G-CSF基因约有73％同源性，与IL-6无论在基因水平以及氨基酸水平上都有很高同源性，包括外显子、内含子组成，Cys数目，两对二硫键位置以及分子的三级结构等。G-CSF主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞如促进ADCC，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。G-CSF还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。因此，提供一种高效表达重组人粒细胞集落刺激因子的方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了重组人粒细胞集落刺激因子。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产重组人粒细胞集落刺激因子蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了一种表达载体，包括重组人粒细胞集落刺激因子的序列以及载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组人粒细胞集落刺激因子的序列为将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化重组人粒细胞集落刺激因子序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：优化的重组人粒细胞集落刺激因子的序列；步骤2：在所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；由金斯瑞克隆到pUC57载体中，获得pCSF克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-CSF。具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本专利技术将人类重组人粒细胞集落刺激因子氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的重组人粒细胞集落刺激因子序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，获得pCSF克隆载体(图1)。基因片段通过XbaI/Sacl从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，产生植物表达载体p35S-CSF(图2)。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。此外，本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达重组人粒细胞集落刺激因子的方法，将本专利技术提供的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得重组人粒细胞集落刺激因子。具体的，将植物表达载体p35S-CSF通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5LYEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/LMgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mMMES，10mMMgSO4)中至O.D.600为0.5。将制备好的含有p35S-CSF农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5；将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(WelchVacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。在本专利技术的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌GV3101。本专利技术所述克隆pCSF基因片段，并且构建双元植物表达载体p35S-CSF(图2)，在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。提取、分离蛋白质具体为：将经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mMKPi，pH7.8；5mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列以及载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述重组人粒细胞集落刺激因子的序列为将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化重组人粒细胞集落刺激因子的序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，马磊，王海军，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US