一种西瓜雌性株的获得方法及应用技术

本发明专利技术属于分子育种领域领域，提供了一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，并利用构建的CRISPR/Cas9载体转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。本发明专利技术还提供了一种利用西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用。本发明专利技术提供的西瓜雌性株的获得方法可以高效快速地获得西瓜雌性株，整个方法省时省工，可以大大提高西瓜优良品种的育种效率，降低育种成本。

A Method for Obtaining Female Watermelon Plants and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种西瓜雌性株的获得方法及应用
本专利技术属于分子育种领域，特别涉及一种利用CRISPR/Cas9技术在西瓜中敲除目的基因，从而获得西瓜雌性株的方法。
技术介绍
西瓜(Citrulluslanatus)为葫芦科中重要经济作物，是世界十大水果性蔬菜。我国是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家，产销量约占世界总产销量的一半。在西瓜育种工作中如何降低制种成本、提高种子纯度是西瓜育种工作的关键。西瓜花可分为雌花及雄花，还有两性花，而各种花在西瓜茎上的着生方式称为西瓜的性型。西瓜的主要性型是雌雄异花同株，因此在西瓜杂交育种工作中需要对雌花进行先期套帽，人工授粉，再套帽防止混杂本株或其他株的花粉，十分费时费工。在西瓜育种中大规模的雌性系或诱导全雌株的应用可以大大降低杂交育种中的人工成本、提高种子纯度。而西瓜雌性系是一种罕见的性型，且西瓜对外源激素处理不敏感，不能诱导雌雄异花同株材料全开雌花，因此研究西瓜雌性株产生的机理，人为创制新型的雌性系材料对西瓜性别分化的理论研究及西瓜杂交制种工作具有重大的理论和实践意义。传统的西瓜育种是对自然界现有变异选育优良品种，而且还要根据需要继续品种间的杂交、回交等工作来获得优良性状，而随着现代生物技术的进步，CRISPR/Cas9基因编辑技术的成熟及广泛应用可以针对目的基因进行简便高效的基因精确编辑，为培育新品种带来了更多的可能性。CRISPR/Cas9可以在不引入外源基因的情况下对基因进行准确编辑，其中2016年4月，一种利用CRISPR/Cas9技术编辑的不会褐变的蘑菇，成为了美国第一个被批准上市的基因编辑农产品。然而，目前并没有一种利用CRISPR/Cas9技术实现在各个西瓜品种中创制雌性株的有效方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术基于西瓜雌性系基因的定位结果，利用CRISPR/Cas9技术及西瓜高效率转化技术提供了一种西瓜雌性株的获得方法，以实现在各个西瓜品种中创制雌性株。本专利技术通过以下技术方案实现：一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，并利用构建的CRISPR/Cas9载体转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。作为优选的实施方式，所述靶点为如下三个靶点中的至少一个：靶点1的序列组成为：5’-GCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；靶点2的序列组成为：5’-CAGGGCTTAAGCTTAGAAG-3’；靶点3的序列组成为：5’-CTACTACTGGACTTAATAA-3’。作为优选的实施方式，所述CRISPR/Cas9载体为单靶点载体，所述载体为PBSE401载体，所述引物为根据靶点选择的由正向引物和反向引物组成的引物对；其中，当选择靶点1时，引物如下：正向引物ST-1F：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；反向引物ST-1R：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’；当选择靶点2时，引物如下：正向引物ST-2F：5’-ATTGCAGGGCTTAAGCTTAGAAG-3’；反向引物ST-2R：5’-AAACCTTCTAAGCTTAAGCCCTG-3’；当选择靶点3时，引物如下：正向引物ST-3F：5’-ATTGCTACTACTGGACTTAATAA-3’；反向引物ST-3R：5’-AAACTTATTAAGTCCAGTAGTAG-3’。作为优选的实施方式，所述构建CRISPR/Cas9载体的操作包括将根据靶点选择的引物对退火形成两头有BsaI黏性末端的双链DNA片段，然后将所述双链DNA片段与PBSE401载体连接，获得双链DNA片段和PBSE401的酶切-连接产物，即CRISPR/Cas9单靶点载体；优选地，还包括将所述CRISPR/Cas9单靶点载体进行扩增的操作；进一步优选地，将所述CRISPR/Cas9单靶点载体进行扩增的操作为将所述CRISPR/Cas9单靶点载体转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。作为优选的实施方式，所述CRISPR/Cas9载体为双靶点载体，所述载体为PBSE401载体，所述引物为根据靶点选择的四个引物；其中，当选择靶点2和3时，四个引物如下：DT3-BsF：5’-ATATATGGTCTCGATTGCTACTACTGGACTTAATAAGTT-3’；DT3-F0：5’-TGCTACTACTGGACTTAATAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；DT2-R0：5’-AACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；DT2-BsR：5’-ATTATTGGTCTCGAAACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAA-3’；当选择靶点1和2时，四个引物如下：DT1-BsF：5’-ATATATGGTCTCGATTGGCTGCATGGCCATGTCCAAGTT-3’；DT1-F0：5’-TGGCTGCATGGCCATGTCCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；DT2-R0：5’-AACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；DT2-BsR：5’-ATTATTGGTCTCGAAACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAA-3’；当选择靶点1和3时，四个引物如下：DT3-BsF：5’-ATATATGGTCTCGATTGCTACTACTGGACTTAATAAGTT-3’；DT3-F0：5’-TGCTACTACTGGACTTAATAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；DT1-R0：5’-AACTTGGACATGGCCATGCAGCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；DT1-BsR：5’-ATTATTGGTCTCGAAACTTGGACATGGCCATGCAGCCAA-3’。作为优选的实施方式，所述构建CRISPR/Cas9载体的操作包括以pCBC-DT1T2为模板，以根据靶点选择的四个引物进行四引物PCR扩增，获得PCR产物，然后将所述PCR产物与PBSE401载体连接，获得所述PCR产物与PBSE401的酶切-连接产物，即CRISPR/Cas9双靶点载体；优选地，还包括将所述CRISPR/Cas9双靶点载体进行扩增的操作；进一步优选地，将所述CRISPR/Cas9双靶点载体进行扩增的操作为将所述CRISPR/Cas9双靶点载体转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。作为优选的实施方式，所述利用构建的CRISPR/Cas9载体转化西瓜组织的操作使用农杆菌进行；优选地，将通过大肠杆菌扩增后的CRISPR/Cas9载体使用农杆菌转化西瓜组织。作为优选的实施方式，所述方法还包括对获得的西瓜雌性株的Gy基因序列进行翻译分析鉴定的操作；优选地，所述翻译分析鉴定的操作包括根据测得的西瓜阳性株的Gy基因序列碱基组成，按照翻译密码子推出Gy基因相应的蛋白质氨基酸序列组成，然后与西瓜Gy蛋白序列进行比对，如果存在差异，说明西瓜阳性株的Gy序列确实发生了有意突变，产生了雌性株。上述西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，并利用构建的CRISPR/Cas9载体转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。

【技术特征摘要】
2019.03.13 CN 20191018731691.一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，并利用构建的CRISPR/Cas9载体转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶点为如下三个靶点中的至少一个：靶点1的序列组成为：5’-GCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；靶点2的序列组成为：5’-CAGGGCTTAAGCTTAGAAG-3’；靶点3的序列组成为：5’-CTACTACTGGACTTAATAA-3’。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9载体为单靶点载体，所述载体为PBSE401载体，所述引物为根据靶点选择的由正向引物和反向引物组成的引物对；其中，当选择靶点1时，引物如下：正向引物ST-1F：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；反向引物ST-1R：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’；当选择靶点2时，引物如下：正向引物ST-2F：5’-ATTGCAGGGCTTAAGCTTAGAAG-3’；反向引物ST-2R：5’-AAACCTTCTAAGCTTAAGCCCTG-3’；当选择靶点3时，引物如下：正向引物ST-3F：5’-ATTGCTACTACTGGACTTAATAA-3’；反向引物ST-3R：5’-AAACTTATTAAGTCCAGTAGTAG-3’。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述构建CRISPR/Cas9载体的操作包括将根据靶点选择的引物对退火形成两头有BsaI黏性末端的双链DNA片段，然后将所述双链DNA片段与PBSE401载体连接，获得双链DNA片段和PBSE401的酶切-连接产物，即CRISPR/Cas9单靶点载体；优选地，还包括将所述CRISPR/Cas9单靶点载体进行扩增的操作；进一步优选地，将所述CRISPR/Cas9单靶点载体进行扩增的操作为将所述CRISPR/Cas9单靶点载体转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9载体为双靶点载体，所述载体为PBSE401载体，所述引物为根据靶点选择的四个引物；其中，当选择靶点2和3时，四个引物如下：DT3-BsF：5’-ATATATGGTCTCGATTGCTACTACTGGACTTAATAAGTT-3’；DT3-F0：5’-TGCTACTACTGGACTTAATAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；DT2-R0：5’-AACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；DT2-BsR：5’-ATTATTGGTCTCGAAACCTTCTAAGCTTAAGCCCTGCAA-3’；当选择靶点1和2时，四个引物如下：DT1-BsF：5’-AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：许勇，张洁，田守蔚，张海英，宫国义，郭绍贵，任毅，李茂营，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，京研益农北京种业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11