一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：外植体的获取、农杆菌的活化、农杆菌侵染与共培养和诱导芽分化及生根。本发明专利技术以卷丹百合无菌小鳞片2~3mm薄层切片为转化材料，通过培养基改良和农杆菌菌液浓度及侵染时间的优化，建立了卷丹百合的高效遗传转化体系。卷丹百合瞬时转化效率为80%以上，稳定转化率为25.00%以上，转化效率高、不易染菌、不易产生嵌合体。本发明专利技术解决了以无菌小鳞片为外植体或单纯利用tTCL技术，获得卷丹遗传转化效率低的问题；同时克服了以卷丹愈伤组织为转化受体，由于愈伤组织对农杆菌过于敏感而最终无法获得转基因植株的缺陷，对农杆菌敏感型百合的遗传转化体系构建具有重要的指导意义和借鉴价值。

A METHOD FOR CONSTRUCTING HIGH EFFICIENCY GENETIC TRANSFORMATION SYSTEM OF Lilium volvacea

【技术实现步骤摘要】
一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法
本专利技术属于百合遗传育种
，具体涉及一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法。
技术介绍
卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)属亚洲系百合，其植株挺立，花型奇特，色橙红且着有黑色斑点，因此又名虎皮百合，斑百合。卷丹百合可食用，也可药用，其鳞茎洁白肥大，富含蛋白质、氨基酸、淀粉、膳食纤维、生物碱和矿物质等多种营养元素，长期食用有降血糖、清肺止咳和清心安神等功效，因此被加工为百合粉、百合干、百合罐头等在市场上进行售卖。卷丹百合生长势强健、适应性强，可抗病毒和镰刀菌，不仅可应用于园林美化环境，也是盆栽的良好材料。同时，卷丹栽培历史悠久，是一种非常少见的三倍体野生百合，在我国各省份均有种植，日本、朝鲜半岛等区域亦有分布。在卷丹百合主产区，主要采用无性繁殖方式，常因病毒聚集而引起种性退化和品质下降，影响了卷丹百合产业的良性发展。因此，培育具有抗病抗逆能力的卷丹百合有着重要的科学意义。卷丹百合为自然存在的3倍体，其花粉通常不育。过去，百合的品种改良主要通过传统育种方法，随着现代分子生物学的发展，利用转基因技术不仅可以克服传统育种中的自交不亲和性，而且通过定向修饰目的性状，缩短了育种周期，然而目前卷丹百合的遗传转化方法尚不清楚。在百合的遗传转化中，常见的受体材料有鳞片、愈伤组织、无菌小鳞片、叶片等。选用室外生长的百合鳞茎的鳞片作为受体的优点是可直接进行侵染，缩短了实验时间，但其弊端是污染率偏高。愈伤组织一般通过鳞片、花丝或花梗等诱导获得，其优点是转化效率高和易扩繁，但其弊端是在分化过程中易出现嵌合体。无菌小鳞茎一般通过直接分化获得，其不定芽分化率高，在再生过程中不易产生嵌合体，但其转化效率低。植物细胞薄层培养技术(thincelllayers，TCL)起源并迅速发展，目前已成功应用于观赏植物的组培快繁中。TCL系统原意是从外植体上撕下厚3～6层细胞(包括表皮细胞、形成层细胞及薄壁细胞)，如今薄层培养也指将外植体横切为厚约1～5mm薄片的培养，即tTCL(transverseTCL)。其对植物生长发育调控机制与分子机制等研究有深远意义。迄今已成功用于烟草、水稻、龙胆、菊花、兰花和月季等植物中，专利技术专利CN201310469178.6公开以鳞片和顶芽为外植体，且采用tTCL的切割培养方式实现了兰州百合的遗传转化，相比传统块状接种方式，在诱导时间上缩短4～5天，诱导系数提高14～17倍，但可能是由于卷丹百合基因型及其对农杆菌的敏感性的限制，采用上述方法得到卷丹百合的转化体的效率低或很难得到转化体。因此，构建适用于卷丹百合的高效遗传转化体系，为后期卷丹百合分子育种和品种改良提供新的理论依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供了一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，解决现有的百合农杆菌转化方法存在转化效率低、易染菌、易产生嵌合体的问题，尤其对于一部分愈伤组织农杆菌敏感型的百合的高效遗传转化体系构建提供技术支撑。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：1)将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36～48h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180～250rpm振荡培养24～36h后，再按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6～0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD600值介于0.2～0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；2)取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2～3mm的薄层切片，作为外植体；3)将步骤2)所述薄层切片放入步骤1)活化好的农杆菌菌液中浸染5～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2～3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根。共培养时间太长，植物的正常生长受到农杆菌产生的有害物质抑制；时间太短，农杆菌对植物细胞相互作用不充分，共培养3～4d最佳。作为优选的，所述改良MS重悬液培养基为MS培养基-(KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+AS100μmol·L-1；所述改良MS共培养基为MS培养基-(KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+6-BA1.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+AS100μmol·L-1。MS培养基中KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2对农杆菌有一定的抑制作用，这样，以薄层切片为外植体，不仅有利于农杆菌对外植体的侵染，同时，由于无菌小鳞片薄层切片细胞不经过脱分化过程，不容易对农杆菌的增殖而发生细胞死亡，从而提高了卷丹百合的转化效率。相比卷丹百合愈伤组织细胞为脱分化的薄壁细胞，容易表现出对农杆菌增殖的敏感性而发生死亡。作为优选的，所述芽分化培养基为MS培养基+100mg·L-1Vc+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+Kan100mg·L-1+Hyg75mg·L-1+Cef400～600mg·L-1+6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖；培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h。Vc是强的还原剂，可以有效的防止薄层切片的伤口发生褐化，同时保护卷丹百合细胞不受农杆菌侵害而发生致死，并能有效促进芽的增殖分化，从而提高了卷丹百合的转化效率。作为优选的，所述生根诱导培养基为MS培养基+Kan100mg·L-1+Hyg75mg·L-1+Cef400～600mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖；培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h。作为优选的，所述侵染时农杆菌菌液的OD600值为0.4，侵染时间为15min。这是由于在农杆菌侵染阶段，侵染浓度(OD600)和时间与受体材料对农杆菌的敏感性、农杆菌的侵染能力以及后期对农杆菌繁殖的控制息息相关。因此，受体材料和外植体不同其具有显著的差异性。本专利技术侵染时间太短，OD600值过低，农杆菌对受体材料作用不充分，导致转化效果差，达不到试验目的；侵染时间太长，OD600值过高，受体材料易受农杆菌毒害，增加污染率，同时易出现褐化死亡现象。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术以卷丹百合无菌小鳞片2～3mm薄层切片为转化材料，选择去除部分无机盐的改良MS悬浮液、改良MS共培养基和复配有Vc的芽分化培养基，通过优化农杆菌菌液浓度和侵染时间，建立了以卷丹百合无菌薄层切片为外植体的高效遗传转化体系。本专利技术为今后卷丹百合的遗传改良提供重要的技术保障，为提高卷丹百合的单产产量和产品品质，以及对其它百合的新品种培育具有重要的指导意义和借鉴价值。2、本专利技术首次建立了以卷丹百合无菌小鳞片2-3mm薄层切片为外植体的组培再生体系。首先通过抗生素敏感性测试，获得了适合卷丹百合遗传转化和抗性筛选的适宜抗生素及其对应浓度，为卷丹百合转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36~48 h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180~250rpm振荡培养24~36h后，再按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6~0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD600值介于0.2~0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；2）取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2~3 mm的薄层切片，作为外植体；3）将步骤2）所述薄层切片放入步骤1）活化好的农杆菌菌液中浸染5～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2~3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根。

【技术特征摘要】
1.一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36~48h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180~250rpm振荡培养24~36h后，再按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6~0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD600值介于0.2~0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；2）取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2~3mm的薄层切片，作为外植体；3）将步骤2）所述薄层切片放入步骤1）活化好的农杆菌菌液中浸染5～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2~3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根。2.根据权利要求1所述构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，所述改良SM重悬液培养基为MS培养基-（KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+AS10...

【专利技术属性】
技术研发人员：符勇耀，杨利平，李宏群，刘建玲，彭慎敏，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50