一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备、应用方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备、应用方法。包括cEYFP盒或nEYFP盒和终止子，其中，所述cEYFP载体结构为Sac1‑EcoRI‑XbaI‑KpnI‑BamHI‑SalI‑PstI‑cEYFP盒‑终止子‑HindIII；nEYFP载体结构为：Sac1‑EcoRI‑XbaI‑KpnI‑BamHI‑SalI‑nEYFP盒‑终止子‑HindIII。本发明专利技术通过提供一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备方法，利用pCAMBIA1301为骨架，通过在多克隆位点(multiple cloning site,MCS)处添加cEYFP盒/nEYFP盒‑终止子等步骤，构建一个便捷操作平台，然后创造性的将胁迫处理融合于蛋白互作中，使蛋白互作直接与基因功能相关联，进而解决了现有载体假阳性高的技术问题，并将蛋白质间的互作与基因功能相关联。

A protein-protein interaction vector directly revealing gene function and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备、应用方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备、应用方法。
技术介绍
蛋白间相互作用几乎在所有的细胞器及亚细胞结构中都有发生，它在细胞的各项生理过程中均承担着重要的角色；阐明蛋白质互作发生的时间、空间以及复合物具体形成过程，能为明确各项生理活动的调节机制以及细胞信号转导途径提供关键性线索。双分子荧光互补(BiFC)技术是近几年被广泛使用的一项技术，它是利用YFP产生的荧光从而验证蛋白之间的互作，同时能够检测蛋白间互作的强弱以及准确定位蛋白互作发生的地点。其基本原理是：将YFP荧光蛋白在中间特定的位点处切开使其分成两段不能单独产生荧光的N端和C端，再将它们分别与2个靶蛋白融合；在当两个靶蛋白能够相互作用时，会使得YFP荧光蛋白的2个片段在空间上相互靠近互补，重新构成能够产生荧光的完整YFP荧光蛋白分子。与其他方法相比，BiFC技术在研究蛋白互作过程中更加简单直观，且不需要使用染料，同时能够在最接近活体细胞的生理状态下使用荧光显微镜直接观察到目标蛋白是否产生互作，该方法已经成为在活细胞内观察蛋白运动及研究蛋白功能的一项强有力技术。目前用于BiFC载体构建通常有两种方法。一种方法是先将荧光基因通过稀有限制性内切酶克隆到中间载体，然后再转移到双元表达载体。此方法存在一些不足之处：首先稀有限制性内切酶比较昂贵，而且不容易酶切与连接，这将大大增加研究过程中的难度。其次，先后连接到中间载体、双元表达载体，此过程比较复杂、繁琐。另一种方法是采用GATEWAY载体，此方法虽然快速、高效，但所用试剂价格昂贵。为了解决上述技术问题，浙江师范大学提出一种改进的研究蛋白互作的双分子荧光互补载体专利(专利号：ZL2010106172126)有效解决了构建双分子荧光互补载体的费用高，连接效率低，过程繁琐等缺点。然而在实际应用过程中，发现该专利中所专利技术载体与前述的类似载体相似，也存在假阳性高的缺点，降低了结果的可信度，使其应用受到较大的局限。
技术实现思路
本专利技术针对上述的双分子荧光互补载体所存在的载体假阳性高，可信度低的技术问题，提出一种载体构建容易且能够将蛋白互作与基因功能紧密联系，克服以往蛋白互作不能说明功能的弊端的一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为，本专利技术提供一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体，包括cEYFP盒或nEYFP盒和终止子，其中，所述cEYFP载体结构为Sac1-EcoRI-XbaI-KpnI-BamHI-SalI-PstI-cEYFP盒-终止子-HindIII；nEYFP载体结构为：Sac1-EcoRI-XbaI-KpnI-BamHI-SalI-nEYFP盒-终止子-HindIII。本专利技术还提供制备一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体的方法，提供基础载体pCAMBIA1301，nEYFP/cEYFP与终止子通过overlap的方式连接到pMD18-T载体上，后通过酶切位点插入到pCAMBIA1301上，即可得到直接揭示基因功能的蛋白互作载体。本专利技术还提供了使用上述直接揭示基因功能的蛋白互作载体进行蛋白互作的一套独特流程，包括以下有效步骤：A、构建上述直接揭示基因功能的蛋白互作载体；B、将靶蛋白的启动子与开放阅读框，分别克隆至上述直接揭示基因功能的蛋白互作载体，使直接揭示基因功能的蛋白互作载体与靶蛋白融合；C、对检测所需的植物进行相应的胁迫处理；D、将B步骤融合好的直接揭示基因功能的蛋白互作载体进行转化处理；E、侵染C步骤中胁迫处理好的植物，激光共聚焦观察，确定靶蛋白的互作情况。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于，本专利技术通过提供一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体及其制备方法，利用pCAMBIA1301为骨架，通过在多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)处添加cEYFP盒/nEYFP盒-终止子等步骤，构建一个便捷操作平台，然后创造性的将胁迫处理融合于蛋白互作中，使蛋白互作直接与基因功能相关联，进而解决了现有载体假阳性高的技术问题。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1提供的pCAMBIA1301-cEYFP-ter载体的关键部分示意图；图2为实施例1提供的pCAMBIA1301-nEYFP-ter载体的关键部分示意图；图3为实施例1提供的1301-pAtCBL10-AtCBL10-nEYFP-ter载体示意图；图4为实施例1提供的1301-pAtCIPK24-AtCIPK24-cEYFP-te载体示意图；图5为实施例1提供的实时监控蛋白互作与盐胁迫的关系图。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。申请人分析了产生假阳性的可能原因，认为由于以往的BiFC双分子荧光蛋白的载体改造所用的均是CaMV35S强启动子，具有很强的活性和表达效率。互作研究过程中强启动子驱动的目的基因高水平表达使得在在细胞器狭小空间内，目的蛋白和两个荧光蛋白片段大量累积，极大增加了它们彼此间物理上靠近的几率，导致即使在不融合其它相互作用蛋白的情况下，也可能会互相结合形成荧光复合体而发出荧光。鉴于上述原因，申请人认为采用基因自身启动子可能会规避这一缺陷；此外，如果用自身启动子驱动，对于那些与逆境相关的基因，可以直接将蛋白互作与基因功能联系起来。为了利用BiFC载体更准确的研究蛋白的互作，降低过程中的假阳性，为此，申请人通过以下两点进行改进，一，改造BiFC载体，实现由自身启动子驱动；二，在进行互作检测时，预先对植物进行相应的胁迫处理。结合以上两点，既可以检测蛋白的互作，降低假阳性，同时将互作与功能进行了有效关联。实施例1第一部分：构建pCAMBIA1301-cEYFP-ter和pCAMBIA1301-nEYFP-ternEYFP、cEYFP和终止子(terminator，以下终止子均用terminator代替)为全部已知序列，序列信息可从NCBI中查询，在很多载体中都有该序列。pCAMBIA1301由本实验室保存，也可以购买；载体pMD18-T购自Takara(大连)公司。本研究克隆nEYFP/cEYFP、终止子所用的引物序列见(表1，表2)。表1克隆克隆nEYFP-terminator所用引物对及预期扩增长度nEYFP与terminator通过ovelap的方式连接起来，设计引物以wcc1617和wcc1618克隆nEYFP，以wc1619和wc217克隆terminator，模板为本实验室保存的LeCBL3-nEYFP-35Sterminator，跑电泳验证得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体，其特征在于，包括cEYFP盒或nEYFP盒和终止子，其中，所述cEYFP载体结构为Sac1‑EcoRI‑XbaI‑KpnI‑BamHI‑SalI‑PstI‑cEYFP盒‑终止子‑HindIII；nEYFP载体结构为：Sac1‑EcoRI‑XbaI‑KpnI‑BamHI‑SalI‑nEYFP盒‑终止子‑HindIII。

【技术特征摘要】
1.一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体，其特征在于，包括cEYFP盒或nEYFP盒和终止子，其中，所述cEYFP载体结构为Sac1-EcoRI-XbaI-KpnI-BamHI-SalI-PstI-cEYFP盒-终止子-HindIII；nEYFP载体结构为：Sac1-EcoRI-XbaI-KpnI-BamHI-SalI-nEYFP盒-终止子-HindIII。2.制备权利要求1所述的一种直接揭示基因功能的蛋白互作载体的方法，其特征在于，提供基础载体pCAMBIA1301，nEYFP/cEYFP与终止子通过overlap的方式连接到pMD18-T载体上...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长春，刘敏，韩佳峰，钟延辉，郑瑶瑶，金一禾，蒋泽炜，陈丽双，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33