植物作为宿主表达人源端粒酶的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主表达人源端粒酶显著延长生物寿命。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达人源端粒酶。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白杂交法确定端粒酶成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出端粒酶。秀丽隐杆线虫的寿命测试结果表明利用该平台技术生产的端粒酶显著延长寿命。

Application of Plant as Host to Express Human Telomerase

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主表达人源端粒酶的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主表达人源端粒酶显著延长生物寿命。
技术介绍
2009年10月5日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将2009年度诺贝尔生理学或医学奖授予3位美国科学家伊利莎芭.布莱克本(ElizabethH.Blackburn),卡萝尔.格雷德(CarolW.Greider)和杰克.绍斯塔克(JackW.Szostak)，以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。他们的发现阐明了端粒酶的作用--使端粒的长度和结构得以稳定，从而保护染色体、细胞随着端粒的变短而衰老，而当端粒酶的活性足以维护端粒的长度时，细胞将会延迟衰老，在癌细胞得到永久性这一过程中，端粒酶的激活起了非常重要的作用。相反，一些遗传病正是由于端粒酶的活性缺陷最终导致细胞的损伤，正是由于三位科学家的开创性工作让人们指导端粒和端粒酶不仅与染色体的特质和稳定性密切相关，而且还设计细胞的衰老与损伤、癌症的发生等方面。端粒酶(Telomerase)是使端粒延伸的反转录DNA合成酶。是个由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白复合物。其RNA组分为模板，蛋白组分具有催化活性，以端粒5'末端为引物，合成端粒重复序列。端粒酶的活性在真核细胞中可检测到，其功能是合成染色体末端的端粒，使因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度得以补偿，进而稳定端粒长度。主要特征是用它自身携带的RNA作模板，以dNTP为原料，通过逆转录催化合成后延长链5‘端DNA片段或外加重复单位。端粒酶在细胞中的主要生物学功能，是通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体端粒DNA的长度。近年有关端粒酶与肿瘤关系的研究进展表明，在肿瘤细胞中端粒酶还参与了对肿瘤细胞的凋亡和基因组稳定的调控过程。与端粒酶的多重生物学活性相对应，肿瘤细胞中也存在复杂的端粒酶调控网络。通过蛋白质-蛋白质相互作用在翻译后水平对端粒酶活性及功能进行调控，则是目前研究端粒酶调控机制的热点之一。但目前的表达系统耗时长，纯化工艺复杂，存在基因污染，感染人体的潜在病虫害等问题，且生产成本较高，存在产品安全性的隐患。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达端粒酶中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了端粒酶。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产端粒酶蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达端粒酶中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。植物瞬时表达技术是在植物生长到一定阶段，利用多种不同的技术方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物细胞中，在植物细胞中建立高效、可控的表达系统，获得该基因短暂的可控表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，仅需几天的时间就可拿到实验结果。与细菌表达系统相比，植物表达系统可以对所表达的蛋白进行正确的折叠、加工、修饰，所生产的蛋白活性高于细菌表达系统；与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的前期投入成本非常低，仅为其百分之一到百分之五。本研究还发现，重组人源端粒酶显著延长秀丽隐杆线虫的寿命。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了一种表达载体，包括端粒酶的序列以及双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述端粒酶为人源端粒酶。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述端粒酶的序列为将端粒酶的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化端粒酶的序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的端粒酶的序列中核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的端粒酶的序列中氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：将端粒酶的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化的端粒酶的序列；步骤2：在所述优化的端粒酶的序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；克隆到pUC57载体中，获得pTelo克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-Telo。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达端粒酶中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达端粒酶的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得端粒酶。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。本专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达人源端粒酶。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用WesternBlot蛋白杂交法确定端粒酶成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出端粒酶。秀丽隐杆线虫的寿命测试结果表明利用该平台技术生产的端粒酶显著延长寿命。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示克隆载体pTelo示意图；图2示端粒酶植物双元表达载体p35S-Telo构建流程；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体切下端粒酶，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Telo；LBandRB:Ti质粒左右边界；35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV35S启动子；NPTII，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos3’，终止子；图3示SDS-PAGE凝胶电泳结果；泳道1：非侵染生菜；泳道2：生菜表达的端粒酶；泳道3：端粒酶商业化产品。具体实施方式本专利技术公开了植物作为宿主在表达端粒酶中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达端粒酶中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了端粒酶。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产端粒酶蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达端粒酶中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达端粒酶中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括端粒酶的序列以及双元植物载体。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述端粒酶为人源端粒酶。4.根据权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于，所述端粒酶的序列为将端粒酶的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化端粒酶的序列。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述优化的端粒酶的序列中核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的端粒酶的序列中氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：将端粒酶的密码子优化为植物偏好的密码子，获得优化的端粒酶的序列；步骤2：在所述优化的端粒酶的序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sa...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，陈书元，唐辉，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US