多药抗体药物偶联物制造技术

本公开提供尤其多药物抗体药物偶联物(MD‑ADC)和连接组装(LA)单元，其通过在位点特异性物质中“正交”脱保护和药物负载构建。还提供了受保护的链接组装单元，其允许“正交”脱保护并构建本公开的MD‑ADC和LA单元。

Multidrug Antibody Drug Coupling

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多药抗体药物偶联物相关申请的交叉引用本申请在35U.S.C§119(e)下要求2016年12月14日提交的美国临时申请No.62/434,333的国内优先权，以及在35U.S.C.§119(a)下的2017年6月13日提交的日本专利申请No.2017-115832的外国优先权，其要求2016年12月14日提交的美国临时申请62/434,333的优先权，其内容出于所有目的通过引用并入本文。关于在联邦政府资助下研究和开发的专利技术的权利的声明不适用在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的参考2017年12月12日创建的名为4200-00111PC-ST25.txt的12KB的序列表通过引用并入本文。
技术介绍
抗体-药物偶联物(ADC)将单克隆抗体的肿瘤靶向特异性与细胞毒性弹头的有效细胞杀伤活性相结合。部分由于最近ADC的临床成功，其中包括本妥昔单抗(ADCETRISTM)在复发性霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤中，和曲妥珠单抗(ado-trastuzumabmertansine)(KADCYLATM)在HER2阳性转移性乳腺癌中的批准，因此人们对设计新的ADC形式产生了浓厚的兴趣。这些新方法中的大多数都集中在解决现有临床分子的一些缺点，例如异质药物负载、有限的药物-接头稳定性，以及具有限制的癌症类型子集的活性的弹头。为了实现改进的ADC，在该领域已经取得了显著的进步。这些包括能够实现同质负载的位点特异性药物-接头偶联策略，具有改善的稳定性的药物-接头连接模式，有力的新有效负载以及利用替代释放机制的接头策略。几乎所有有效的癌症化学疗法都使用旨在克服异质肿瘤细胞群体内不同药物敏感性的互补药物组合。该策略最近已应用于ADC，目前正在与未偶联的，临床批准的抗癌药物联合进行测试。此外，新兴的ADC临床和临床前数据已经证明，通过使用相同的抗体施用单独的ADC，可以通过提供替代弹头来克服对特定ADC的不敏感性。在这里，我们通过描述用于靶向癌细胞抗原的抗体的可获得的双细胞毒性药物偶联技术，在单个ADC内公开了互补药物有效负载，这构成了靶向药物递送领域的重大进步。该技术适用于其他靶向剂，证明了正交硫醇保护基团首次用于制备不依赖于工程化抗体的ADC。我们提供了第一个数据，证明与常规ADC相比，具有双重偶联药物(MD-ADC)的多种药物ADC表现出增强的体外和体内活性。在MD-ADC技术的一个示例中，具有互补生理化学性质的两种不同的，高效的他汀(奥瑞他汀)分子与单一抗体偶联，其增强对异质癌细胞群的ADC活性。通常使用的他汀药物-接头，也称为他汀链接组装单元，包括mc-MMAF(1)、mc-vc-MMAF(2)和mc-vc-MMAE(3)。来自mc-vc-MMAE药物接头的释放药物单甲基他汀E(MMAE)是细胞可渗透的并且表现出旁观者活性，或杀死相邻的抗原阴性癌细胞。然而，MMAE也是多重耐药(MDR)输出物的底物，因此对具有高MDR表达的细胞的活性降低。相反，分别从mc-vc-MMAF和mc-MMAFADC释放的MMAF和cys-mc-MMAF对药物输出不易感并且保留对MDR(+)细胞的活性，但是细胞可渗透性最小。因此，它们没有表现出旁观者活性并且对抗原阴性肿瘤细胞几乎没有活性。结合两种类型药物的特征可以提供癌症的互补活性，产生具有增强的细胞毒性谱的ADC。迄今为止，仅报道了MD-ADC的单个实例，但是该工作是在抗体Fab片段上进行的，并且需要遗传引入工程化半胱氨酸(eCys)残基以实现位点特异性区分偶联位点(Puthenveetil等.BioconjugateChem.(2016)27(4)：1030-1039)。已经提出了许多其他方法用于将两种单独的试剂与抗体的位点特异性偶联(Maruani等，Org.Biomol.Org.(2016)14(26)：6165-6178)，但是这些方法中的大多数需要专门的试剂，包括位点特异性氨基酸突变或定制酶，有时需要两个不同的偶联手柄。所有这些因素都增加了生成和筛选MD-ADC所需的试剂的复杂性。一种这样的方法利用哒嗪-二酮重新连接还原的天然抗体二硫化物，然后进行双击功能化以构建基本上同质的产物，但该方法仅用于产生荧光团-药物抗体偶联物并且在消耗抗体上两个可偶联的位点，从而减少潜在的总药物负载。所需要的是将双重药物结合到单个链接组装单元中的方法(和ADC)，每个单元仅需要一个可偶联位点，并且导致两种药物以特定比例同质地和位点特异性地负载。该方法不应依赖于需要限制性eCys位点或酶介导的偶联的工程化抗体，并且应该适用于可以在一系列抗体上筛选的药物组合，包括商业抗体和杂交瘤抗体库。本公开解决了这些和其他需要。
技术实现思路
本文提供了多药抗体药物偶联物(MD-ADC)，其包含抗体和一至八个共价连接的链接组装单元(LA)，其中多达八个共价连接的链接组装单元中的每一个连接至通过还原抗体中的链间二硫键产生的硫醇和/或每个共价连接的LA单元与来自工程化半胱氨酸残基的硫醇连接，并且其中每个共价连接的链接组装单元具有与其相连的2-4个药物部分，也称为药物单元，其中两个药物单元是不同的，并且具有任选的分配剂(Y)。这些MD-ADC的具体实施方式提供在式(I)、(II)、(III)和(IV)中，以及式(I*)、(II*)、(III*)和(IV*)中。本文还提供了可用于制备MD-ADC的链接组装单元，其由式(Ia)、(IIa)、(IIIa)(IVa)和(XIIIa)表示。另一方面，本文提供了受保护的链接组装单元(用于制备链接组装单元和MD-ADC)，其由下述式(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(IVb)和(XIIIb)体现。另一方面，本文提供了具有1至8个正交保护的链接组装单元的抗体偶联物。在其他方面，本文提供了使用所述MD-ADC的药物组合物和治疗疾病的方法。附图的简要说明图1A和1B显示在偶联(A)和脱保护(B)后轻链和重链抗体的反相分离后的总离子色谱图(TIC)和UV色谱图(280nm)。主要轻链和重链种类的解卷积质谱显示在色谱仪的右侧，显示了预期和观察到的质量。注意，由于N-连接聚糖的异质性，存在多种重链质量种类。仅注意到重链的G0糖型质量。LC＝轻链，HC＝重链。图2A和2B显示在乙酰氨基甲基(Acm)脱保护和随后的N-乙基马来酰亚胺(NEM)添加后cAC10-mc-Cys的解卷积轻链质量，其包括用QMP树脂先前处理(A)或不包括(B)。仅在(A)中观察到向释放的硫醇中添加NEM。图3表明汞介导的Acm脱保护不影响抗体链间二硫键的完整性。将马来酰亚胺己酰-Cys(Acm)与cAC10(S239C)偶联，每个抗体2个载体。该偶联物具有完整的链间二硫键。使偶联物经受汞介导的Acm脱保护条件和随后的N-乙基马来酰亚胺(NEM)偶联(约20摩尔当量)。显示了轻链和重链的反相分离后轻链和重链的解卷积质谱。该分析表明，只有一个NEM分子被添加到重链中，并且没有发生轻链的修饰。这表明汞处理不会影响抗体链间二硫键。如果汞处理破坏了二硫键，预计会增加多个NEM。注意，由于N-连接聚糖的异质性，存在多种重链质量种类。仅注意到重链的G0糖型质量。LC＝轻链，HC＝重链图4显示反应示意图，其包括对载体4上的C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多药抗体药物偶联物(MD‑ADC)，其包含抗体和八个共价连接的链接组装单元(LA)，每个链接组装单元具有两个不同的药物单元D

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.06.13 JP 2017-115832;2016.12.14 US 62/434,3331.一种多药抗体药物偶联物(MD-ADC)，其包含抗体和八个共价连接的链接组装单元(LA)，每个链接组装单元具有两个不同的药物单元D1和D2，其中八个所述共价连接的链接组装单元中的每一个与通过还原所述抗体中的链间二硫键产生的硫醇连接，并且其中每个所述共价连接的链接组装单元具有两至四个与其连接的总药物单元和任选的分配剂(Y)。2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于,D1和D2分别是第一抗癌剂和第二抗癌剂。3.如权利要求2所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述第一抗癌剂和第二抗癌剂具有互补的活性谱。4.如权利要求2所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述第一抗癌剂和第二抗癌剂是MMAE和MMAF。5.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述第一抗癌剂和第二抗癌剂是喜树碱和多柔比星。6.如权利要求1-5所述的抗体药物偶联物，其特征在于,连接至所述链接组装单元的所述两至四个总药物单元通过硫醇/马来酰亚胺偶联产生。7.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述链接组装单元还包括分配剂。8.如权利要求7所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述分配剂是聚乙二醇单元。9.如权利要求7所述的抗体药物偶联物，其特征在于,所述分配剂是环糊精单元。10.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，具有式(I)：其中，Ab是抗体，为非工程化抗体；T是附着到通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇的拴系基团；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；X是连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X、Q2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。11.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,Q1是具有通过L1连接到Q1中存在的硫醇的D1的半胱氨酸基团；和Q2是具有通过L2连接到Q2中存在的硫醇的D2的半胱氨酸基团。12.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,下标n为0。13.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,下标n是1，且Y包括聚乙二醇基团。14.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,X是氨基酸或二肽或三肽。15.如权利要求14所述的抗体药物偶联物，其特征在于,X中存在的每个氨基酸选自由以下组成的组：甘氨酸和丙氨酸。16.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,T是自稳定接头组装件。17.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,各自L1和L2独立地选自马来酰亚胺基-己酰基(mc)、马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc)、马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-vc-PABC)和马来酰亚胺二氨基丙酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MDPr-vc)。18.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于,下标n为0，并且L1和L2中的至少一个包含连接的分配剂(Y)。19.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，具有结构：其中P1是聚乙二醇基团。20.如权利要求19所述的抗体药物偶联物，其特征在于,L1和L2各自独立地选自由以下组成的组：马来酰亚胺基-己酰基(mc)，马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc)和马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-vc-PABC)。21.如权利要求19所述的抗体药物偶联物，其特征在于,D1和D2独立地选自由以下组成的组：MMAE、奥瑞他汀T、MMAF和尾海兔素10。22.如权利要求19所述的抗体药物偶联物，其特征在于,D1和D2独立地选自由以下组成的组：MMAE、喜树碱、Superdox、尾海兔素10，长春碱和环丙沙星。23.如权利要求1所述的多药抗体药物偶联物(MD-ADC)，其包含抗体和八个共价连接的链接组装单元(LA)，其中八个所述共价连接的LA单元中的每一个连接至通过还原所述抗体中的链间二硫键产生的硫醇，其中每个所述共价连接的LA单元具有总共三个与其连接的药物单元D1和D2，其中D1与D2的摩尔比为2：1。24.如权利要求23所述的抗体药物偶联物，具有式(II)：其中，Ab是抗体，为非工程化抗体；T是附着到通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇的拴系基团；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；每个X独立地是一个连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X、Q2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。25.权利要求23所述的抗体药物偶联物，具有式(III)：其中，Ab是抗体，为非工程化抗体；T是附着到通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇的拴系基团；每个Q1都是独立选择的第一连接基团；Q2是第二连接基团；X1和X2各自独立地为连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；每个L1都是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X1、X2、Q2、L1或L2上的站点的分配剂；和下标n为0或1。26.如权利要求23所述的抗体药物偶联物，具有式(IV)：其中，Ab是抗体，为非工程化抗体；T是附着到通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇的拴系基团；Q1是独立选择的第一连接基团；每个Q2都是第二连接基团；X1和X2各自独立地为连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；每个L2都是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X1、X2、Q2、L1或L2上的站点的分配剂；和下标n为0或1。27.如权利要求10-24所述的抗体药物偶联物，其特征在于,D1和D2是选自由以下药物对组成的组：MMAE/MMAF、MMAE/喜树碱、Superdox/喜树碱、Superdox/MMAE、尾海兔素10/MMAE、尾海兔素10/MMAF、长春碱/MMAE和长春碱/MMAF。28.具有式(Ia)的药物链接组装单元：其中，T是拴系基团，它可以与通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇连接；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；X是连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X、Q2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。29.具有式(IIa)的药物链接组装单元：其中，T是拴系基团，它可以与通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇连接；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；每个X独立地是连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X、Q2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。30.具有式(IIIa)的药物链接组装单元：其中，T是拴系基团，它可以与通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇连接；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；X1和X2各自独立地为附接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地选自0和1；Y是附着到L、Q1、X1、Q2、X2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。31.具有式(IVa)的药物链接组装单元：其中，T是拴系基团，它可以与通过还原抗体的链间二硫键产生的硫醇连接；Q1是第一连接基团；Q2是第二连接基团；X1和X2各自独立地为连接基团接头；D1是第一药物单元；D2是第二药物单元；L1是任选的链接基团，将D1连接到Q1；L2是任选的链接基团，将D2连接到Q2；下标m1和m2各自独立地为0或1；Y是附着到L、Q1、X1、Q2、X2、L1或L2上的位点的分配剂；和下标n为0或1。32.如权利要求28、29、30或31中任一项所述的药物链接组装单元，其特征在于,L包含马来酰亚胺基。33.如权利要求28、29、30或31中任一项所述的药物链接组装单元，其特征在于,L包含马来酰亚胺基，并且X、X1、X2、Q1和Q2中的每一个是氨基酸。34.如权利要求33所述的药物链接组装单元，其特征在于,下标n为0且Y不存在。35.如权利要求33所述的药物链接组装单元，其特征在于,下标n为0，Y不存在，且L1和L2各自独立地选自由以下组成的组：马来酰亚胺基-己酰基(mc)、马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc)，和马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-vc-PABC)。36.如权利要求28-35所述的药物链接组装单元，其特征在于,T包括末端马来酰亚胺基。37.如权利要求36所述的药物链接组装单元，其特征在于,T是自稳定接头。38.如权利要求36所述的药物链接组装单元，其特征在于,T包括下式的式(VII)：其中RPR是氢或保护基团，下标m是1或2，且R23是-NH-C1-5亚烷基-C(＝O)-，或单、二肽、三肽、四肽或五肽。39.如权利要求36所述的药物链接组装单元，其特征在于,T包括下式：40.如权利要求36所述的药物链接组装单元，其特征在于,T是MDPr-vc接头。41.具有式(Ib)的正交保护的链接组装单元：其中，T是具有末端马来酰亚胺部分的拴系基团；Q1是包含第一半胱氨酸部分或其类似物的第一连接基团；Q2是包含第二半胱氨酸部分或其类似物的第二连接基团；X是连接基团接头；P1是第一硫醇保护基团；P2是第二硫醇保护基团，且P1和P2不同；Y是附加到L、Q1、X或Q2的分配剂；和下标n为0或1。42.具有式(IIb)的正交保护的链接组装单元：其中，T是具有末端马来酰亚胺部分的拴系基团；Q1是包含第一半胱氨酸部分或其类似物的第一连接基团；Q2是包含第二半胱氨酸部分或其类似物的第二连接基团；每个X都是连接基团接头；P1是第一硫醇保护基团；P2是第二硫醇保护基团，且P1和P2不同；Y是附加到L、Q1、X或Q2的分配剂；和下标n为0或1。43.具有式(IIIb)的正交保护的链接组装单元：其中，T是具有末端马来酰亚胺部分的拴系基团；Q1是包含第一半胱氨酸部分或其类似物的第一连接基团；Q2是包含第二半胱氨酸部分或其类似物的第二连接基团；X1和X2各自独立地为连接基团接头；P1是第一硫醇保护基团；P2是第二硫醇保护基团，且P1和P2不同；Y是附加到L、Q1、X或Q2的分配剂；和下标n为0或1。44.具有式(IVb)的正交保护的链接组装单...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·R·列文古德，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国,US