一种高效的基因工程载体制造技术

本发明专利技术提供5’到3’分别为T‑F‑GOI；T‑GOI‑F；F‑T‑GOI；F‑GOI‑T；GOI‑T‑F；GOI‑F‑T；F‑GOI；GOI‑F；或P‑F‑GOI；P‑GOI‑F；F‑P‑GOI；F‑GOI‑P；GOI‑P‑F；GOI‑F‑P；F‑GOI；GOI‑F所示核苷酸构建物，各元件如说明书所述。利用该核苷酸构建物可将大量外源基因整合在基因组中，但不破坏整合位点附近的基因功能，不影响宿主细胞的生存。

An Efficient Vector for Gene Engineering

【技术实现步骤摘要】
一种高效的基因工程载体
本专利技术涉及生物
；具体地说，本专利技术涉及通过两次重组而将大量外源基因整合在生物机体的基因组中，同时避免破坏宿主细胞基因功能的新型基因工程载体。
技术介绍
N-糖基化是蛋白翻译后的一个重要修饰过程，对蛋白的结构和功能起着重要的作用。哺乳动物细胞和酵母细胞在内质网腔合成新生肽链的同时，对新生肽链进行相同的N-糖基化起始步骤及修饰加工过程，首先前体寡糖G1c3Man9GlcNAc2被连接到新生肽链Asn-X-Thr/Ser(X为除Pro外的任意氨基酸)保守序列中的Asn残基上，然后在葡萄糖苷水解酶I、Ⅱ和甘露糖苷水解酶I等糖苷水解酶的作用下，蛋白的糖链被加工形成Man8GlcNAc2糖链结构，随后带有该糖链的蛋白被转运至高尔基体中。但是在哺乳动物细胞和酵母高尔基体内，蛋白糖链的进一步修饰加工过程则完全不同。在哺乳动物细胞高尔基体内，蛋白上的Man8GlcNAc2糖链首先在甘露糖苷水解酶I(MnsI)的作用下，去除三个甘露糖，形成Man5GlcNAc2糖链结构；然后在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)的作用下添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAcMan5GlcNAc2糖链结构；然后在甘露糖苷水解酶II(MnsII)的作用下，再去除两个甘露糖，形成GlcNAcMan3GlcNAc2糖链结构；接着在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)的作用下再添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAc2Man3GlcNAc2糖链结构；最后在半乳糖转移酶(GalT)和唾液酸转移酶(ST)的作用下，加工形成Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和Sia2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2复杂型糖链结构。但是在酵母细胞高尔基体内，在OCH1基因编码的α-l,6-甘露糖转移酶(Ochlp)的作用下,蛋白上的Man8GlcNAc2糖链首先接受一个α-l,6-甘露糖，形成Man9GlcNAc2糖链结构，然后在其它各种甘露糖转移酶的作用下继续添加甘露糖，形成高甘露糖型的糖链结构。因此，用酵母生产蛋白的一个主要缺陷是对蛋白N-糖基化修饰形成与人体不同的高甘露糖链，它可能改变糖蛋白的结构，影响其功能，具有免疫原性(Kornfeld,R.&Kornfeld,S.Assemblyofasparagine-linkedoligosaccharides.Annu.Rev.Biochem.54,631–664,1985)。应用基因工程技术可以改造酵母的糖基化修饰途径，使其能对蛋白进行与人体相同的N-糖基化修饰。为了达到这个目标，不仅需要敲除酵母的OCH1基因，还需要表达大量的外源基因，包括合适的甘露糖苷水解酶I(MnsI)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)、甘露糖苷水解酶II(MnsII)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)、半乳糖转移酶(GalT)、唾液酸转移酶(ST)、以及与半乳糖和唾液酸生物合成相关的基因等(HamiltonSR,DavidsonRC,SethuramanN,NettJH,JiangY,RiosS,etal.Humanizationofyeasttoproducecomplexterminallysialylatedglycoproteins.Science2006；313:1441-3)。为了将这些外源基因整合在酵母基因组中进行表达，需要有不同的载体、选择标记、和基因组整合位点可供选择使用。有些载体，包括pBLADE-SX,、pBLARG-SX、pBLHIS-SX,、pBLURA3-SX等，利用选择表记基因ADE1、ARG4、HIS4、URA3等生物合成基因，通过单交换重组将外源基因整合在对应的营养缺陷型酵母细胞的基因座上。整合的载体通过对酵母营养缺陷的互补作用(原养型)可以在不完全培养基中筛选出来。例如携带有HIS4基因的pBLHIS-SX载体可以将外源基因通过单交换重组整合在组氨酸缺陷型GS115菌的his4基因座上，补偿其组氨酸缺陷，用不含组氨酸的培养基筛选出来(LinCereghinoGP,LinCereghinoJ,SungaAJ,JohnsonMA,LimM,GleesonMA,CreggJM.Newselectablemarker/auxotrophichoststraincombinationsformoleculargeneticmanipulationofPichiapastoris.Gene.2001,263:159-69)。也有些载体利用显性选择标记基因，通过单交换重组将外源基因整合在酵母的特定基因座上。例如GlycoSwitch载体利用博来霉素(zeocin)，诺尔丝菌素(noureothricin)，遗传霉素(G418)，潮霉素(hygromycin)等显性选择标记基因将外源的MnsI、GnTI、MnsII、GnTII、和GalT基因整合在毕赤酵母细胞的AOX1或GAPDH基因启动子上(JacobsP,GeysensS,VerveckenW,ContrerasR,CallewaertN,Engineeringcomplex-typeN-glycosylationinPichiapastorisusingGlycoSwitchtechnology,NatProtoc.2009；4:58-70)。但是通过单交换重组将外源基因载体整合在酵母基因组的靶基因位点时，会形成靶基因的同向重复序列。同向重复的靶基因序列之间可以再次发生同源重组，切除整合的外源载体，恢复靶基因原来的状态。而且，通过同向重复序列之间不同位置的同源重组可以将靶基因恢复成野生型或者缺陷型的状态，无法通过选择筛选条件来防止同源重组切除载体过程的发生。因此，通过单交换重组整合在基因组中的外源基因载体，具有遗传不稳定性。与单交换重组不同，有些载体利用选择标记基因，通过双交换重组能将外源基因载体稳定整合在酵母基因组中，是基因工程改造的优先选择。例如pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2和pHIL-S1(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)等载体，通过双交换重组将外源基因整合在毕赤酵母的AOX1基因座上，结果产生MutS表型，在有甲醇的培养基中生长缓慢。另外利用URA5标记基因，通过双交换重组将外源基因稳定整合在ura3营养缺陷型毕赤酵母的OCH1基因座上。(NettJH,GerngrossTU,CloninganddisruptionofthePpURA5geneandconstructionofasetofintegrationvectorsforthestablegeneticmodificationofPichiapastoris,Yeast.2003,20:1279-90)。但是目前通过这些载体的双交换重组，主要将外源基因整合在基因组的个别已知基因座上，同时破坏这些基因座的基因表达和功能不会影响宿主细胞的生存。但是在酵母基因组中这些已知的基因座整合位点很少，无法满足整合大量外源基因的需求。因此，目前的基因操作技术对基因组进行大规模改造受到许多限制，主要在于缺乏可供大量使用的表达载体、选择标记，以及基因组基因座的整合位点。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：5’H‑T‑F‑GOI‑3’H；5’H‑T‑GOI‑F‑3’H；5’H‑F‑T‑GOI‑3’H；5’H‑F‑GOI‑T‑3’H；5’H‑GOI‑T‑F‑3’H；5’H‑GOI‑F‑T‑3’H；5’H‑F‑GOI‑3’H；5’H‑GOI‑F‑3’H；其中，T是外源性终止子；F为B‑C‑Marker‑B所示基因片段；其中B是位点特异性重组位点；C是所述位点特异性重组位点相对应的重组酶表达盒；Marker是标记基因表达盒；GOI是外源基因表达盒；或者，所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构：5’H‑F‑GOI‑P‑3’H；5’H‑GOI‑F‑P‑3’H；5’H‑P‑F‑GOI‑3’H；5’H‑P‑GOI‑F‑3’H；5’H‑F‑P‑GOI‑3’H；5’H‑GOI‑P‑F‑3’H；5’H‑F‑GOI‑3’H；5’H‑GOI‑F‑3’H；其中，P是外源性启动子；F、B、C、Marker和GOI如上所述。

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：5’H-T-F-GOI-3’H；5’H-T-GOI-F-3’H；5’H-F-T-GOI-3’H；5’H-F-GOI-T-3’H；5’H-GOI-T-F-3’H；5’H-GOI-F-T-3’H；5’H-F-GOI-3’H；5’H-GOI-F-3’H；其中，T是外源性终止子；F为B-C-Marker-B所示基因片段；其中B是位点特异性重组位点；C是所述位点特异性重组位点相对应的重组酶表达盒；Marker是标记基因表达盒；GOI是外源基因表达盒；或者，所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构：5’H-F-GOI-P-3’H；5’H-GOI-F-P-3’H；5’H-P-F-GOI-3’H；5’H-P-GOI-F-3’H；5’H-F-P-GOI-3’H；5’H-GOI-P-F-3’H；5’H-F-GOI-3’H；5’H-GOI-F-3’H；其中，P是外源性启动子；F、B、C、Marker和GOI如上所述。2.如权利要求1所述的核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：5’H-T-F-GOI-3’H；5’H-T-GOI-F-3’H；5’H-F-T-GOI-3’H；5’H-F-GOI-T-3’H；5’H-GOI-T-F-3’H；5’H-GOI-F-T-3’H；其中，T、F、GOI如权利要求1所述；或者，所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构5’H-F-GOI-P-3’H；5’H-GOI-F-P-3’H；5’H-P-F-GOI-3’H；5’H-P-GOI-F-3’H；5’H-F-P-GOI-3’H；5’H-GOI-P-F-3’H；其中，P、F和GOI如权利要求1所述。3.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述转录终止子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、CYC1和TIF51A等转录终止子，毕赤酵母的ALG6、AOD、AOX1、ARG4、PMA1和TEF1等转录终止子；转录启动子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、GAP、PGK1和TEF1等转录启动子，毕赤酵母的GAP、ILV5、PGK1、TEF1等转录启动子，诱导启动子AOX1和FLD1等；所述位点特异性重组位点以及相应的重组酶构成位点特异性重组系统，包括但不限于酿酒酵母的Flp-FRT，细菌噬菌体P1的Cre-loxP和Xygosaccharomycesrouxii的R-RS；标记基因包括一个或多个抗生素...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜有为，李云飞，
申请(专利权)人：杭州菁因康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33