制备糖蛋白-药物偶联物的方法技术

本发明专利技术提供一种用于修饰糖蛋白的方法。本发明专利技术还提供一种用于制造糖蛋白‑酬载偶联物的方法，以及由此产生的偶联物。

Preparation of glycoprotein-drug conjugates

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备糖蛋白-药物偶联物的方法
本专利技术涉及一种修饰糖蛋白以使得糖蛋白包含一或多个三甘露糖基核心的方法。本专利技术还关于糖蛋白-酬载(payload)偶联物，其包含本专利技术的糖蛋白和相关酬载。
技术介绍
治疗性蛋白药物已在临床上广泛使用，且因为其价值高、特异性高和毒性低的优势，所以世界上一些大型医药公司致力于研发此类药物进行临床试验。这些治疗性蛋白中的大部分为单克隆抗体。尽管有一些患者对其临床结果感到满意，但是临床试验数据表明，这些抗体中的一些的治疗效果仍需改良，尤其是在癌症治疗中。为了克服此缺点，科学家开始聚焦于透过一些技术来修饰这些临床抗体，以便增进其在癌症疗法中的功效。在这些技术中，抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)因为其对于化学制造管制(chemistry,manufacturingandcontrol，CMC)友善、对用户友善且副作用较低而备受关注。迄今为止，市场上有4种治疗性抗体-药物偶联物可供使用，包括和还有许多其它药物正在研发当中(库比泽克(Kubizek)F1,艾格里奇(Eggenreich)B1,斯帕杜特(Spadiut)O1.蛋白质和肽快报(ProteinPeptLett.)2017,24(8):686-695；费舍尔(Fischer)E.,罗格希卜利(RogerSchibli)R.抗体(Antibodies)2015,4,197-224；萨普拉(Sapra),P.,霍伯(Hooper),A.,奥唐尼尔(O'Donnell),C.和戈伯(Gerber),H.-P.研究药物专家意见(ExpertOpin.Investig.Drugs)2011,20,1131-1180；弗吕加勒(Flygare),J.,皮洛(Pillow),T.和阿里斯托夫(Aristoff),P.,化学生物学与药物设计(Chem.Biol.DrugDes.)2013,81,113-121；帕诺斯基(Panowski),S.；巴克塔(Bhakta),S.；拉布(Raab),H.；波拉吉斯(Polakis),P.和尤努图拉(Junutula),J.R.用于癌症疗法的位点特异性抗体药物结合物(Site-specificantibodydrugconjugatesforcancertherapy).单克隆抗体(MAbs)2013,6,34-45)。在这些临床ADC中，Kadcyla和Mylotarg是通过酬载或连接基团与赖氨酸残基的氨基随机偶联所形成，而(维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)(cAC10-vcMMAE，SGN-35))则为嵌合抗CD30单克隆抗体，其中融合了鼠抗CD30抗体AC10的可变重链区与轻链区。平均4(2-8)个MMAE分子与SGN-30架构偶联。MMAE的偶联点是通过链间双硫键的温和还原产生的半胱氨酸残基的随机-SH基团。连接基团由硫醇反应性顺丁烯二酰亚胺基己酰基间隔子、二肽缬氨酸-瓜氨酸连接基团和PABC间隔子组成(弗兰斯克(Francisco)JA,科文尼(Cerveny)CG,梅耶(Meyer)DL,米克桑(Mixan)BJ,克拉斯曼(Klussman)K,蔡斯(Chace)DF,雷尼克(Rejniak)SX等人cAC10-vcMMAE.血液(Blood)2003,4,1458-65)。虽然所述技术容易使酬载或连接基团与抗体偶联，但是因为多个赖氨酸序列和抗体中的半胱氨酸残基的最佳还原反应的问题，这两种技术难以控制偶联物的药物抗体比(drug-to-antibodyratio，DAR)。这些现象经常造成抗体产物的异质性且诱发CMC问题。一些文献甚至指出这种类型的第一代非位点特异性ADC具有PK和免疫原性的缺点。为解决第一代ADC的这些缺点，研发了位点特异性ADC平台，包括SMART标签、非天然氨基酸任何酪氨酸、治疗性转肽酶(sortase)、硫桥(Thio-Bridge)等。正如我们所期望的，这些技术能够通过对亲本抗体中的一些特异性位点或结构域进行工程改造而产生均质ADC产物。举例而言，硫桥技术将连接基团和酬载与抗体的部分还原的双硫键连接。SMART标签是通过使抗体的相邻序列突变为细菌氧化酶的底物序列的技术。所得产物与甲醛一起用作为连接基团与酬载的连接位点。正如预期，这些第二代ADC技术能够产生具有独特的DAR和高均质性的ADC产物。然而，因为天然抗体的突变，ADC产物可能具有PK和免疫原性问题。目前，经由N-糖基化使酬载与抗体偶联吸引了大量关注，这是因为成功研发出了抗体的糖基化工程改造(glycolengineering)。所有天然存在的IgG和重组抗体均在重链CH2恒定区中的每一个的位置297处具有氨基酸天冬酰氨酸(Asn297)，其为一个N-糖基化位点。通过在哺乳动物细胞中的糖基化和后修饰，经由IgG上的N-糖基化形成两个双触状聚糖部分，且双触状聚糖部分各自基本上由具有下式的至少7个糖部分构成：其中第一GlcNAc(GlcNAc1)分别键结至抗体的Asn297和第二GlcNAc(GlcNAc2)，且任选地键结至海藻糖(Fuc)；GlcNAc2进一步键结至第一甘露糖(Man1)；第二和第三甘露糖(Man2和Man3)分别键结至Man1的α-1,3和α-1,6位置；且另外两个GlcNAc糖(GlcNAc3和GlcNAc4)分别键结至Man2和Man3的β-1,2位置。具有所述聚糖部分与海藻糖的抗体表示为G0F，然而，当海藻糖部分不存在时，抗体为G0。(T.理珊莎拉朱(ShanthaRaju)单克隆抗体.2012年5月1日；4(3):385-391)。当GlcNAc3或GlcNAc4键结至额外的半乳糖时，抗体表示为G1F/G1抗体。当抗体的聚糖部分中的末端GlcNAc糖分别键结至两个额外的半乳糖时，抗体表示为G2F/G2抗体。由哺乳动物细胞产生的抗体一般可包括G0F(大于约40％)、G1F(约30％-40％)和G2F(小于1％)以及极少量的连接至唾液酸的G1F/G1和G2F/G2。因为在N297聚糖中的各分枝位点进行工程改造可维持结构完整且产生一些功能多样性(例如抗体的ADCC、半衰期和CDC)，已研发出一些N297糖基化工程改造ADC平台且其中一些产品正处于临床试验阶段。WO2014/164534A2、WO2014/065661A1、WO2015/032899A1、WO2015/057064A1、WO2015/157446A1、US8716033B2、US7416858B2、EP2753752B3和综述文章(生物结合物化学(BioconjugChem.)；2015年11月18日；26(11):2070-5)已公开诸多用于抗体药物偶联的经修饰聚糖部分。然而，在这些技术中无法充分控制抗体-药物偶联中的药物抗体比(DAR)且不能实现酬载多样性，因此在所属领域中需要控制ADC的药物抗体比且提高酬载多样性。本专利技术满足此需要且提供其它益处。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供一种用于制造包含式(1)的结构的糖蛋白-酬载偶联物的方法：本专利技术的另一方面提供一种用于制造包含式(5)的结构的糖蛋白-酬载偶联物的方法：本专利技术的另一方面提供一种用于制造包含式(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备包含式(1)的结构的糖蛋白‑酬载偶联物的方法，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.29 US 62/440,0751.一种用于制备包含式(1)的结构的糖蛋白-酬载偶联物的方法，所述方法包含以下步骤：(i)使包含具有式(2)的聚糖的糖蛋白与β-N-乙酰葡萄糖胺酶反应，产生包含式(3)的三甘露糖基核心的经修饰糖蛋白(ii)使包含式(3)的三甘露糖基核心的经修饰糖蛋白与UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R在甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶和甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶存在下反应，其中R为叠氮基、酮基或醛，使得两个GlcNAc-(CH2)0-8-R糖分别键结至Man2和Man3各自的β-1,2位置，且借此形成式(4)的聚糖部分以及(iii)使两个偶联剂-连接基团-酬载与式(4)的聚糖部分反应，其中所述两个偶联剂-连接基团-酬载的所述酬载相同或不同，产生包含式(1)的结构的糖蛋白-酬载偶联物。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中的所述包含具有式(2)的聚糖的糖蛋白和所述β-N-乙酰葡萄糖胺酶是由哺乳动物细胞系产生。3.根据权利要求2所述的方法，所述哺乳动物细胞系为经SV40转形的猴肾CV1株(COS-7)、人类胚肾株(293或293T细胞)、幼仓鼠肾细胞(babyhamsterkidneycell，BHK)、小鼠塞特利氏细胞(mousesertolicell)(TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人类宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛鼠肝细胞(BRL3A)、人类肺细胞(W138)、人类肝细胞(HepG2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞或骨髓瘤细胞系。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖蛋白为抗体或其片段，例如来自裂解抗体的抗体Fab片段、F(ab')2、Fv片段或Fc片段、scFv-Fc片段、微型抗体、双功能抗体或scFv。5.根据权利要求1所述的方法，其中R为叠氮基，所述偶联剂为炔基，且步骤(iii)中进行的反应为点击反应(clickreaction)。6.根据权利要求1所述的方法，其中R为酮基或醛，所述偶联剂为氨基，且步骤(iii)中进行的反应为还原胺化。7.根据权利要求1所述的方法，其中R为酮基或醛，所述偶联剂为β-芳基乙氨基，且步骤(iii)中进行的反应为皮克特-施彭格勒反应(Pictet-Spenglerreaction)。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接基团为选自具有2至20个碳原子的直链或分支链烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、酰基、烷基氨基或芳基氨基、含有双硫键的连接基团、酸不稳定连接基团、光不稳定连接基团、肽酶不稳定连接基团和酯酶不稳定连接基团。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酬载独立地选自治疗剂和标记。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述治疗剂选自抗代谢物、烷基化剂、类烷基化剂、DNA小沟烷基化剂、蒽环霉素(anthracycline)、抗生素、卡奇霉素(calicheamicin)、抗有丝分裂剂、拓朴异构酶抑制剂(topoisomeraseinhibitor)、蛋白酶体抑制剂和放射性同位素。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记为荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记或正电子发射体。12.一种糖蛋白-酬载偶联物，其包含如权利要求1中所定义的式(1)的结构。13.一种用于制造包含式(5)的结构的糖蛋白-酬载偶联物的方法，所述方法包含以下步骤：(i)使包含如权利要求1中所定义的式(3)的三甘露糖基核心的经修饰糖蛋白与UDP-GlcNAc-(CH2)0-8-R在甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶存在下反应，其中R为叠氮基、酮基或醛，使得GlcNAc-(CH2)0-8-R糖键结至Man2的β-1,2位置，且借此形成包含式(6)的聚糖部分的糖蛋白以及(ii)使偶联剂-连接基团-酬载与包含式(6)的聚糖部分的糖蛋白反应，产生包含式(5)的结构的糖蛋白-酬载偶联物。14.根据权利要求13所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡士昌，李俊忠，李孟昇，陈金尧，庄士贤，陈怡仁，魏文胤，
申请(专利权)人：财团法人生物技术开发中心，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71