一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒，所述的方法包含：步骤(1)，设计若干PCR引物对，PCR引物包含：一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列；所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接；步骤(2)，取含有循环肿瘤DNA的模板，并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应，获得第一次PCR反应产物；步骤(3)，在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶，以消化残留的PCR引物；步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。本发明专利技术具有降低样本损失的效果。

A Method and Kit for Enriching Circulating Tumor DNA Based on Multiplex PCR

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法和试剂盒。
技术介绍
随着人类基因组完成图完成，人类进入后基因组时代。在后基因组时代，首先要求利用人类基因组DNA序列信息来研究基因及其变异，以检测变异带来的功能改变。通常肿瘤的发生涉及多个基因的发生发展，针对单一基因变化的研究就显示出很大的局限性，只有全面检测多个基因的碱基突变，才能有效监控MRD，用药指导，治疗疗效和术后治疗等。近年来，针对ctDNA(循环肿瘤DNA，CirculationtumorDNA)，即“液体活检”在临床中的应用，开展了广泛的研究，覆盖肿瘤全程管理的方方面面：如肿瘤筛查、分子诊断、转移或复发监测、实时监测疗效、探寻新的靶点和耐药机制等。ctDNA指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段，其带有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变。cfDNA(游离DNA，circulating-freecellDNA)是指存在于血浆或血清的细胞外DNA。ctDNA包含在cfDNA中，是肿瘤患者cfDNA中的一部分。研究结果显示，ctDNA检测可早于72％的影像学诊断的肿瘤复发，中位提前时间为5.2个月。证明ctDNA检测的灵敏度及特异性较高，且显著早于影像学可诊断的微小复发灶，可用于MRD的早期诊断，并以此指导这部分患者的早期干预和个体化的辅助治疗。NGS测序技术(Next-generationsequencingtechnology)作为一种新兴生物技术，虽然各国学者已经看到了它的重要应用价值，但是由于其高假阳性率，错配率，高成本，低重复率等缺陷，使该技术的迅速发展和广泛应用受到了一定的限制。ctDNA检测技术中，根据富集策略的不同，基于NGS的技术目前可分为靶向扩增子测序及目标序列捕获测序。靶向扩增子测序是针对目的基因设计几十甚至上百对PCR引物，利用多重PCR扩增富集靶标序列。目标序列捕获测序是针对目的基因设计探针，通过捕获杂交的方法富集。捕获法的缺点是时间长，操作复杂，而扩增子法的优势是操作简单，时间短，可以快速检测，更早的检出结果。PCR过程中，对于不同的反应体系，延伸反应产物保真需要的退火温度是不同的，在高变化的退火温度范围内，Tag酶等低保真DNA聚合酶引入的错误率和假阳性率高，近年发现的Pfu高保真DNA聚合酶具有严格的模板依赖性和3’-5’外切酶活性(校正活性)，能依据模板用3’-5’校正酶活性将引物3’端多个不匹配碱基校正成与模板匹配而扩增出非目的性产物，并在较宽的退火温度范围内仍适用。所以单用Pfu高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应同样会出现非特异性条带。IonTorrent测序平台由于有成本低，检测周期短等优点，被广泛应用于检测平台中，但是由于IonTorrent平台的测序原理，决定了测序中会引入一些错误，特别是短片段缺失的错误。在检测循环游离DNA样本时，由于检测的样本中ctDNA样本的含量低，检测的结果和PCR过程中引入的错误和测序平台引入的错误混杂在一起，无法有效区分开检测错误，导致检测结果为假阴性或者假阳性。另外检测ctDNA样本时，因为样本中肿瘤分子含量少，检测需要很高的灵敏度，建库过程中，需要损失的肿瘤分子越少越好。但是目前的大多数检测过程，中间都会带有磁珠纯化的步骤，而每一次的纯化步骤，必然会导致样本损失，导致检测的灵敏度降低。为了更好的利用ctDNA优化患者的全程管理，一种能快速检测ctDNA的方法或试剂，以及同时具有高敏感性和特异性的液体活检平台不可或缺。通过动态定量监测癌症患者ctDNA中的分子突变数，可预测患者的治疗疗效和预后，将液体活检推向一个新的高度。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，这种方法的样本损失量小，检测灵敏度和检测特异性高。为了达到上述目的，本专利技术提供的一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其包含以下步骤：步骤(1)，设计若干PCR引物对，PCR引物上带有U碱基，所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物均包含：一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列；所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接；步骤(2)，取含有循环肿瘤DNA的模板，并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应，获得第一次PCR反应产物；步骤(3)，在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶，以消化残留的PCR引物；所述的组合酶包含：用于将所述的第一次PCR反应产物中的U碱基切除并降解单链DNA片段的第一类酶、以及用于将所述第一次PCR反应产物中的双链DNA上的U修复为T的第二类酶；步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。较佳地，所述的PCR引物上的U碱基的个数为1个或者1个以上。较佳地，所述的第一类酶包含UDG酶、APendonuclease酶和核酸外切酶I，所述的第二类酶包含T4多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。较佳地，步骤(1)中，所述的正向引物和反向引物还均包含：一段UMI分子标签序列。较佳地，步骤(1)中，所述的UMI分子标签序列为UNNNACTNNNTGAU。较佳地，所述的通用测序接头包含：一段通用测序引物序列、一段带有唯一标识的样本标签序列、一段接头连接序列；所述的接头连接序列用于与所述的引物连接序列互补结合。本专利技术还提供了基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法的另一方案，其包含以下步骤：步骤(1)，设计若干PCR引物对，该PCR引物对小于30对，所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物均包含：一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列；所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接；步骤(2)，取含有循环肿瘤DNA的模板，并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应，获得第一次PCR反应产物；步骤(3)，在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶，以消化残留的PCR引物；所述的组合酶包含：用于消化单链引物、形成发卡结构的引物或者引物二聚体的第三类酶；步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。较佳地，所述的第三类酶包含核酸外切酶I、核酸外切酶VII、EndoIV、Klenow大片段、T4DNA聚合酶及T7核酸内切酶I。本专利技术还提供了一种循环肿瘤DNA富集试剂盒，所述的试剂盒包含：上述的带有U碱基的PCR引物、所述的第一类酶、所述的第二类酶及所述的通用测序接头。本专利技术还提供了另一种循环肿瘤DNA富集试剂盒，所述的试剂盒包含：上述的带有U碱基的PCR引物、所述的第一类酶、所述的第二类酶及通用测序接头；该试剂盒还包含：不带U碱基的PCR引物、所述的第三类酶、所述的第四类酶。当PCR引物对小于30对或者大于30对时，可以采用不同的方案对循环肿瘤DNA进行富集，有利于节约成本。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1.本方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤(1)，设计若干PCR引物对，PCR引物上带有U碱基，所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物均包含：一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列；所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接；步骤(2)，取含有循环肿瘤DNA的模板，并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应，获得第一次PCR反应产物；步骤(3)，在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶，以消化残留的PCR引物；所述的组合酶包含：用于将所述的第一次PCR反应产物中的U碱基切除并降解单链DNA片段的第一类酶、以及用于将所述第一次PCR反应产物中的双链DNA上的U修复为T的第二类酶；步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤(1)，设计若干PCR引物对，PCR引物上带有U碱基，所述的PCR引物对包含正向引物和反向引物，所述的正向引物和反向引物均包含：一段用于扩增基因目标区域的扩增引物序列、及一段引物连接序列；所述的引物连接序列用于与测序平台的通用测序接头连接；步骤(2)，取含有循环肿瘤DNA的模板，并将所述模板和步骤(1)所述的PCR引物对一起进行第一次PCR反应，获得第一次PCR反应产物；步骤(3)，在所述的第一次PCR反应产物中加入组合酶，以消化残留的PCR引物；所述的组合酶包含：用于将所述的第一次PCR反应产物中的U碱基切除并降解单链DNA片段的第一类酶、以及用于将所述第一次PCR反应产物中的双链DNA上的U修复为T的第二类酶；步骤(4)，将通用测序接头加入到第一次PCR反应产物中，进行第二次PCR反应，以获得测序文库。2.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，所述的PCR引物上的U碱基的个数为1个或者1个以上。3.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，所述的第一类酶包含UDG酶、APendonuclease酶和核酸外切酶I，所述的第二类酶包含T4多聚核苷酸激酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。4.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的正向引物和反向引物还均包含：一段UMI分子标签序列。5.根据权利要求4所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的UMI分子标签序列为UNNNACTNNNTGAU。6.根据权利要求1所述的基于多重PCR富集循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，所述的通...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡微菁，徐泽，
申请(专利权)人：常州桐树生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32