无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法，该无血清培养基包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA中的几种。本发明专利技术提供的方案能够有效地促进原代肿瘤细胞的生长，抑制和去除成纤维细胞等杂质细胞。

Serum-free medium, preparation method and method of primary cancer cell culture

【技术实现步骤摘要】
无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法
本专利技术涉及细胞体外培养
，特别涉及一种无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法。
技术介绍
原代肿瘤细胞因刚从组织中分离，生物学特性未发生很大变化，可以很好的保持原始状态的肿瘤生物学特性。由于遗传背景差异，不同的患者发病的机制及治疗敏感性均存在个体性差异，因此，自体肿瘤细胞原代培养是研究患者肿瘤发病机制及肿瘤细胞分子生物学特性的重要手段。人工模拟肿瘤细胞在体外的生存环境是肿瘤细胞原代培养的基础，肿瘤细胞的生存环境除需无菌、温度、PH值、湿度等环境因素外，最主要的是培养基，它给细胞提供生长所需的营养物质。目前细胞进行原代培养及建系最常用的是含10％的胎牛血清的基础培养液进行培养。但是应用该肿瘤细胞培养技术培养原代肿瘤细胞，成功率非常低。这是因为含血清培养基成分不明确；而且使用血清有可能促进某些细胞的生长(如成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(如表皮细胞)，血清中含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。在血清取材过程中还有可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。血清还存在批间差异较大，性能不稳定等缺点。无血清培养更利于细胞生长，而且批间次一致性高，可消除来自血清的不均一性，增加确定性，也不存在动物伦理方面的争议。近些年发展的一些原代肿瘤细胞无血清培养基使原代肿瘤细胞培养的成功率有所提高。但现有的无血清培养基在培养原代肿瘤细胞过程中，仍然不能有效地抑制和去除原代肿瘤细胞中的主要混杂成分成纤维细胞。
技术实现思路
本专利技术实施例提供了一种无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法，能够有效地促进原代肿瘤细胞的生长，抑制和去除成纤维细胞等杂质细胞。一方面，一种无血清培养基，包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA中的几种。进一步地，所述基础培养液，包括：DMEM、RPMI1640、F12培养基中的任意一种或多种组合成的混合培养液。进一步地，所述无血清培养基，进一步包括：10～40nM成纤维细胞抑制剂。进一步地，所述抗生素包括：硫酸卡那霉素、链霉素、青霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南等的一种或几种。进一步地，所述抗生素包括：20～500μg/mL青霉素、20～500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5～3μg/mL万古霉素、5～20μg/mL头孢美唑钠中的几种。进一步地，所述添加物包括：1～5mM谷氨酰胺、5～30mg/L胰岛素；5～20mg/L转铁蛋白，5～20μg/L亚硒酸钠，5～20μg/LEGF，10～100nM氢化可的松以及1～5mg/mLBSA。另一方面，上述任一所述的无血清培养基的制备方法，包括：配制添加物中的各个组分的母液，过滤除菌备用；将各个组分的母液按浓度比例加入到基础培养基中，混匀。进一步地，所述配制添加物中的各个组分的母液，包括：将谷氨酰胺溶解于PBS中，配制成一定浓度的谷氨酰胺母液；将胰岛素溶于1mM的乙酸中，配制成一定浓度的胰岛素母液；将氢化可的松溶解于无水乙醇中，配制成一定浓度的氢化可的松母液；将EGF溶于5％的海藻糖溶液中，配制成一定浓度的EGF母液；将转铁蛋白溶解于PBS中，配制成一定浓度的转铁蛋白母液；将亚硒酸钠溶解于PBS中，配制成一定浓度亚硒酸钠母液；将BSA溶解于PBS中，配制成一定浓度的BSA母液。进一步地，所述谷氨酰胺母液中谷氨酰胺浓度为200-400mM；所述胰岛素母液中胰岛素浓度为2-10mg/mL；所述氢化可的松母液中氢化可的松浓度为50-100μM；所述EGF母液中EGF浓度为1-10μg/mL；所述转铁蛋白母液中转铁蛋白浓度为20-50mg/mL；所述亚硒酸钠母液中亚硒酸钠浓度为1-100μg/mL；所述BSA母液中BSA浓度为20-200mg/mL。进一步地，上述无血清培养基的制备方法，进一步包括：将成纤维细胞抑制剂溶解于DMSO中，配制成一定浓度的成纤维细胞抑制剂母液；将一定浓度的成纤维细胞抑制剂母液按浓度比例加入到基础培养基中，混匀。进一步地，所述基础培养液，包括：DMEM、RPMI1640、F12中的任意一种或多种组合成的混合培养液。又一方面，上述任一所述的无血清培养基培养原代肿瘤细胞的方法，包括：将分离得到的原代肿瘤细胞与所述无血清培养基混匀后，种植于胶原蛋白包被的细胞培养容器中培养，其中，所述胶原蛋白包被包括1型胶原蛋白；每隔2-3天更换新鲜的所述无血清培养基，至细胞汇合度达到70％-90％时，传代纯化，并继续以所述无血清培养基维持培养。本专利技术实施例提供了一种无血清培养基、制备方法以及培养原代肿瘤细胞的方法，该无血清培养基包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA中的几种，该无血清培养基能够有效地促进肿瘤细胞生长，抑制成纤维细胞等杂质细胞。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术一个实施例提供的无血清培养基的制备方法的流程图；图2是本专利技术一个实施例提供的利用无血清培养基培养原代肿瘤细胞的方法的流程图；图3是本专利技术一个实施例提供的无血清培养基培养的原代肠癌细胞的形态图；图4是本专利技术一个实施例提供的无血清培养基培养的胸腺瘤细胞的形态图；图5是本专利技术一个实施例提供的无血清培养基培养的肺癌细胞的形态图；图6是本专利技术一个实施例提供的无血清培养基培养的胃癌细胞的形态图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一方面，本专利技术实施例提供一种无血清培养基，该包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，添加物包括谷氨酰胺、胰岛素；转铁蛋白，亚硒酸钠，EGF，氢化可的松以及BSA中的几种。上述无血清培养基能够有效地促进肿瘤细胞生长，抑制成纤维细胞等杂质细胞。本专利技术实施例中的无血清培养基是指用来培养肿瘤细胞的基质。对于肿瘤细胞的类型没有特殊限制，如肠癌细胞、胸腺瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞等。此外，本专利技术的无血清培养基可以是固体粉末状培养基，也可以是液体培养基，优选是液体培养基。当本专利技术的培养基是固体粉末状培养基时，优选在使用时将其调制成液体培养基来进行肿瘤细胞培养。其中，基础培养液是指本
公知的用于细胞培养(优选用于上皮细胞培养)的培养基，包括但不限于DMEM(Dulbecco’sModifiedEssentialMedium)，F12培养基，F10培养基，RPMI1640，Eagle’sBasalMedium(EBM)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清培养基，其特征在于，包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA中的几种。

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养基，其特征在于，包括：基础培养液、添加物以及抗生素，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA中的几种。2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养液，包括：DMEM、RPMI1640、F12培养基中的任意一种或多种组合成的混合培养液；和/或，所述无血清培养基，进一步包括：10～40nM成纤维细胞抑制剂。3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述抗生素包括：硫酸卡那霉素、链霉素、青霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南等的一种或几种。4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，所述抗生素包括：20～500μg/mL青霉素、20～500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5～3μg/mL万古霉素、5～20μg/mL头孢美唑钠中的几种。5.根据权利要求1至4任一所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加物包括：1～5mM谷氨酰胺、5～30mg/L胰岛素；5～20mg/L转铁蛋白，5～20μg/L亚硒酸钠，5～20μg/LEGF，10～100nM氢化可的松以及1～5mg/mLBSA。6.权利要求1至5任一所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括：配制添加物中的各个组分的母液，过滤除菌备用；将各个组分的母液按浓度比例加入到基础培养基中，混匀。7.根据权利要求6所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述配制添加物中的各个组分的母液，包括：将谷氨酰胺溶解于PBS中，配制成一定浓度的谷氨酰胺母液；将胰岛素溶于1mM的乙酸中，配...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾玉霞，佟洪梅，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11