包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，该用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。本发明专利技术提供的方案实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。

Separation and Culture of Envelope Solution and Primary Tumor Cells

【技术实现步骤摘要】
包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法
本专利技术涉及细胞体外培养
，特别涉及一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法。
技术介绍
随着人们生活水平的日益改善，肿瘤患者日益增加，且呈年轻化趋势。为研究其发病机制和治疗，目前已建立了不同肿瘤的肿瘤细胞株。但经过长期培养，肿瘤细胞株的生物学特异性发生变异，不利于其癌变、分子遗传、免疫学特性以及浸润转移演变机制等的研究。对于原代培养的肿瘤细胞来说，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90％以上，适用于药物敏感性试验及机制探究相关试验。另外，通过原代培养技术建立相应的肿瘤细胞库，可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源。因此，建立合理、稳定、高效的肿瘤细胞原代培养模式已成必然。由于原代肿瘤细胞的培养过程过于复杂、贴壁速度慢、细胞数量少、纯度低且培养困难等，现有的原代肿瘤细胞的培养方法，往往需要采用比较大的组织样本进行培养。而很多情况下获得的组织样本并不能满足现有的培养方法的需求，也就是说，对于具有组织样本小，混杂成纤维细胞以及微生物多样性等特点的肿瘤细胞组织如肠癌细胞组织、胃癌细胞组织等来说，现有的一些原代肿瘤细胞培养基很难用来培养原代肿瘤细胞。因此，开发针对较小的组织样本的促进细胞贴壁的包被液以及分离培养方法则显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术实施例提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。一方面，一种用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。优选地，所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。优选地，所述包被液Ⅲ为40-100mMNaOH、200-300mMNaHCO3以及100-250mMHEPES组成的混合液。另一方面，一种原代肿瘤细胞分离培养方法，包括：将权利要求1至3任一所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的细胞培养容器；通过清洗液清洗肿瘤组织；顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；当培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。优选地，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：在1-2mlDF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20mlDF培养基重悬后，第一次离心3～5min，移除上清；向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，，置于37℃CO2培养箱中，振荡消化20～120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3～5min，移除上清；向第二次离心后的细胞沉淀中加入3～5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mLDF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。优选地，所述顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞，包括：通过200-300μm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；将重悬后的细胞接种至包被的细胞培养容器中培养；所述包被的细胞培养容器内的细胞贴壁后，将培养基换成含抗生素的无血清培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养，并每隔2～3天换一次所述含抗生素的无血清培养基。优选地，所述基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞，包括：去除所述含抗生素的无血清培养基；用1～2mlEDTA-Trypsin消化处理；显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，并第四次离心3～5min；用DF10培养基对第四次离心后的肿瘤细胞重悬，将重悬后细胞放于细胞培养容器中，并置于37℃，5％CO2细胞培养箱中5～120min，使成纤维细胞先贴壁；将未贴壁的原代肿瘤细胞收集起来，加入DF10培养基转入新的细胞培养容器继续培养，反复贴壁2-6次。优选地，所述清洗液为含有抗生素的生理盐水、含有抗生素的PBS以及含有抗生素的培养基中的任意一种或多种。优选地，所述细胞分散酶，包括：胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶以及弹性蛋白酶中的任意一种或多种。优选地，所述细胞消化液，包括：浓度为0.02％～0.05％的EGTA和浓度为0.2％～0.5％的Trypsin。优选地，所述抗生素，包括：硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南中的任意多种。优选地，所述无血清培养基，包括：DF培养基和添加物，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松中的任意多种。优选地，所述抗生素，包括：20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠中的多种。优选地，所述无血清培养基，包括：DF培养基、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF以及BSA。优选地，所述细胞分散酶，包括：胶原酶和透明质酸酶。本专利技术实施例提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，该用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为10×F12，包被液Ⅲ为NaOH溶液、NaHCO3溶液以及HEPES组成的混合液，该用于促进细胞贴壁的包被液固化在细胞培养容器底部，接种细胞后，促进细胞贴壁，该促进细胞贴壁能够比较高效的收集肿瘤细胞，可实现只需较小的组织样本，即能够收集满足肿瘤细胞培养、纯化所需的细胞量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术一个实施例提供的原代肿瘤细胞分离培养方法的流程图；图2是本专利技术一个实施例提供的清洗后的肠癌组织样本图；图3是本专利技术一个实施例提供的肠癌细胞纯化前和纯化后对比培养图；图4是本专利技术一个实施例提供的纯化后原代肠癌细胞初步免疫荧光鉴定图；图5是本专利技术一个实施例提供的清洗后的胸腺瘤组织样本图；图6是本专利技术一个实施例提供的胸腺瘤细胞纯化前和纯化后对比培养图；图7是本专利技术一个实施例提供的纯化后原代胸腺瘤细胞初步免疫荧光鉴定图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。

【技术特征摘要】
1.一种用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。2.根据权利要求1所述的用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。3.根据权利要求1或2所述的用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，所述包被液Ⅲ为40-100mMNaOH、200-300mMNaHCO3以及100-250mMHEPES组成的混合液。4.一种原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，包括：将权利要求1至3任一所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的细胞培养容器；通过清洗液清洗肿瘤组织；顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；当培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。5.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：在1-2mlDF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20mlDF培养基重悬后，第一次离心3～5min，移除上清；向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，置于37℃CO2培养箱中，振荡消化20～120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3～5min，移除上清；向第二次离心后的细胞沉淀中加入3～5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mLDF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。6.根据权利要求4或5所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞，包括：通过200-300μm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；...

【专利技术属性】
技术研发人员：智慧芳，佟洪梅，贾玉霞，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11