小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1‑CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。本发明专利技术还提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。本发明专利技术分离并培养获得的循环肿瘤细胞质量均一，经过免疫荧光、增殖、侵袭迁移及致瘤能力实验鉴定符合循环肿瘤细胞的特性，是实验室研究肿瘤转移较好的实验对象，也为临床预测乳腺癌转移、检测化疗药物敏感性提供了良好的研究模型。本发明专利技术的循环肿瘤细胞分离及培养方法简单，成本低，易于操作，分离的细胞可传代，为实验室研究循环肿瘤细胞特性、肿瘤转移机制提供了很好的研究工具。本发明专利技术在肿瘤转移研究方面将会有广泛的应用。

Circulating Tumor Cell Line of Mouse Breast Cancer and Its Establishment

【技术实现步骤摘要】
小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
本专利技术属于生物技术
，具体涉及小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。
技术介绍
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，并且是女性肿瘤相关死亡的主要原因，据2015年统计，在中国有大约27万乳腺癌新增病例，大约7万患者死亡，肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，而循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移过程中起到了关键作用。国内外大量研究证实乳腺癌患者血液中循环肿瘤细胞与患者临床分期、预后及肿瘤转移复发密切相关。2018年美国AJCC指南中将循环肿瘤细胞列为乳腺癌预后评估的一项生物学指标。故循环肿瘤细胞的早期捕获对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都具有重要的指导作用。循环肿瘤细胞的检测有创伤小易重复的优点，故循环肿瘤细胞的捕获、分离及培养技术是关键环节。目前为止，尚未见到小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系建立的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。本专利技术提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201930。本专利技术提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：(1)取乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的外周血至枸橼酸钠抗凝剂中，得到抗凝血，将抗凝血轻轻移至含有小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心，吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗后离心，获得细胞沉淀；(2)将步骤(1)得到的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养24h-48h后，更换培养液，之后每48h更换一次培养液，通过更换培养液将悬浮的白细胞清除，得到贴壁生长的细胞，即为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞。作为优选，步骤(1)中，所述乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步骤：用无菌PBS重悬处于对数生长期的乳腺癌细胞系4T1单细胞，接种至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪垫，饲养35天到40天，至小鼠模型出现消瘦、衰竭状态。作为优选，步骤(1)中，所述小鼠模型为SPF级BALB/c小鼠。作为优选，步骤(2)中，所述DMEM1640培养基中还加入1％青链霉素。作为优选，步骤(2)中，待贴壁生长的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系细胞密度达到70-80％时开始传代培养。作为优选，所述传代培养的具体方法为：弃掉培养液，用无菌PBS液漂洗后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室温消化，当细胞变圆后，加入含有10％FBS的DMEM1640培养液将细胞吹散制备为单细胞悬液，然后将细胞悬液移至培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。作为优选，所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的冻存方法为：将处于对数生长期的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室温消化为单细胞，离心获得细胞沉淀，缓慢加入细胞冻存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，次日在液氮中保存。作为优选，所述细胞冻存液由DMEM1640培养基、胎牛血清和二甲基亚砜组成，DMEM-1640：胎牛血清：二甲基亚砜的体积比＝6:3:1。作为优选，所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的复苏方法为：将冻存的细胞放置于37℃水浴锅中水浴融化，离心，获得细胞沉淀，加入含有10％FBS的DMEM-1640培养基置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每48h更换一次培养液。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术分离并培养获得的循环肿瘤细胞质量均一，经过免疫荧光、增殖、侵袭迁移及致瘤能力实验鉴定符合循环肿瘤细胞的特性，是实验室研究肿瘤转移较好的实验对象，也为临床预测乳腺癌转移、检测化疗药物敏感性提供了良好的研究模型。本专利技术的循环肿瘤细胞分离及培养方法简单，成本低，易于操作，分离的细胞可传代，为实验室研究循环肿瘤细胞特性、肿瘤转移机制提供了很好的研究工具。本专利技术在肿瘤转移研究方面将会有广泛的应用。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1和图2为捕获的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞4T1-CTC。图3和图4为鉴定获得的循环肿瘤细胞是否是上皮来源。图5为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的增殖能力比较。图6为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力比较。图7为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力统计学分析。图8为通过Transwell迁移实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞迁移能力比较。图9为通过Transwell侵袭实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞侵袭能力比较。图10和图11为通过体内皮下成瘤实验比较循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞皮下致瘤能力。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1(一)本实施涉及的相关实验试剂和实验用品(1)200mL小鼠外周血淋巴细胞分离液。(2)枸橼酸钠抗凝剂。(3)DMEM1640培养基(Hyclone)。(4)FBS(胎牛血清)(BI)，含有10％FBS的DMEM1640培养液：DMEM1640培养基于FBS按照体积比9:1混合。(5)PBS液(0.01M)。(6)0.25％胰蛋白溶液(Hyclone)。(7)细胞冻存液：6mLDMEM1640培养基、3mLFBS与1mLDMSO(Sigma)混匀，4℃保存，现配现用。(二)乳腺癌原位转移瘤动物模型建立1.1实验鼠和细胞系准备(1)扩增乳腺癌细胞系4T1，具体扩增方法为：从中国科学院上海细胞库购买鼠源性乳腺癌细胞4T1，用含10％FBS的DMEM1640培养基培养，并加入1％的青链霉素，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，待细胞密度达到80％即可进行传代扩增，弃去培养基上清，无菌PBS漂洗两遍，加入胰蛋白酶消化约3min，用含10％FBS的DMEM1640培养基重悬，按照1:3进行细胞传代扩增。(2)购买SPF级BALB/C小鼠，10只一组，在兰州大学动物中心SPF环境中按照SPF级动物饲养标准进行饲养，自由饮水。1.2乳腺原位肿瘤接种1.2.1材料准备：医用手套、口罩、高压灭菌的手术器械，手术架，酒精。1.2.2具体步骤(1)细胞计数，保证细胞数量足够每只2×106个细胞，将扩增的处于对数生长期的4T1细胞用无菌PBS液按照每只150μL进行稀释，混匀得到单细胞悬液。(2)将小鼠固定，找到第四对乳腺，酒精棉球消毒右侧第四对乳腺，用镊子轻轻提起右侧第四对乳腺，注射器平行进针至乳腺脂肪垫，进针后用镊子固定针头，缓慢注射细胞悬液，注射结束后，用酒精棉球轻轻按压注射部位防止出血感染。(3)继续饲养35天到40天后，BALB/C小鼠出现消瘦状态，准备取血。(三)乳腺癌原位肿瘤细胞分离培养过程用乙醚麻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1‑CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。

【技术特征摘要】
1.小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201930。2.小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的外周血至枸橼酸钠抗凝剂中，得到抗凝血，将抗凝血轻轻移至含有小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心，吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗后离心，获得细胞沉淀；(2)将步骤(1)得到的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养24h-48h后，更换培养液，之后每48h更换一次培养液，通过更换培养液将悬浮的白细胞清除，得到贴壁生长的细胞，即为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞。3.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步骤：用无菌PBS重悬处于对数生长期的乳腺癌细胞系4T1单细胞，接种至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪垫，饲养35天到40天，至小鼠模型出现消瘦、衰竭状态。4.根据权利要求2或3所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述小鼠模型为SPF级BALB/c小鼠。5.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述DMEM1640培养基中还加入1％青链霉素。6.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，金延玲，武雯程，罗晶，徐凯，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62