一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，属于等温核酸扩增技术领域。本发明专利技术首先通过对3型人腺病毒(HAdV‑3)基因测序和比对，设计了用于检测HAdV‑3的特异性引物对和探针，并设计了内参探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示，在此基础上建立了含内参的双重等温核酸扩增体系，进一步构建了用于检测3型腺病毒的试剂盒。本发明专利技术方法在等温条件下进行，5‑20min内可实现同时对3型腺病毒和内参DNA的扩增，灵敏度高、特异性好、内参的加入排除了假阴性和无效结果，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用，该方法适用于对3型腺病毒的快速检测。

A Rapid Method for Detecting Human Adenovirus Type 3 by Dual Isothermal Nucleic Acid Amplification with Intrinsic Parameters

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测3型人腺病毒的靶序列、特异性引物和靶探针，本专利技术还涉及利用特异性引物、靶探针、内参探针进行双重等温核酸扩增检测3型腺病毒的方法和试剂盒。
技术介绍
人腺病毒(HAdV)常引起呼吸道系统感染、腹泻疾病、眼部感染以及生殖道和泌尿系统的感染等，不同亚属的病毒可引起不同的疾病，其中A、F和G主要引起消化道感染以呼吸道感染为主，B、C和E主要引起呼吸道感染，D亚属常常眼部结膜组织的感染。B和C亚属是世界范围内引起急性呼吸道感染的常见病原体，其中我国腺病毒感染暴发流行的主要型别是B亚属的HADV-3,也是全球最普遍流行的HAdV型别，几乎在各个国家都有其暴发或流行的报道。飞沫通过空气传播是腺病毒的主要传播途径，另外可通过粪口传播和接触传播。虽然腺病毒普遍易感，但HAdV-3是我国非缺陷儿童和成人的腺病毒重症肺炎的首要病原菌，通常引起的病情较重，甚至有生命危险，因此腺病毒的分型检测显得尤为重要。人腺病毒是属于腺病毒科乳腺动物腺病毒属的一种无包膜球形的双链DNA病毒，目前对腺病毒的检测方法主要分为免疫学方法、病毒培养法和分子生物学检测法等方法。免疫学方法包括直接荧光法(DFA)和双抗体夹心酶链免疫法(ELISA)，两种方法都对设备等要求条件较低，可以快速检测出病毒，所以得到了较为广泛的应用，但却具有对于早期未产生抗体时的病情无法诊断和采血对人体造成创伤等缺点。病毒分离法是通过观察特征性细胞致病作用(CPE)来分离腺病毒，被认为是诊断腺病毒的“金标准”，即使病毒有变异也能很好的分离检测，但其培养细胞耗时较长，成本较高，对技术水平要求较高，不能满足临床快速诊断的需求，也不适用于现场的疾病快速诊断。目前常用的分子生物学技术是以聚合酶链反应(PCR)为基础的变温扩增技术，包括PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR和温度恒定的等温扩增技术，包括LAMP、RPA、NASBA等，国内外围绕这些技术建立一些较为成熟的腺病毒检测方法。PCR方法可以实现快速检测，具有高灵敏度和特异性等优点，即便核酸含量较少也能检测，但其操作过程繁琐，且对仪器设备要求较高，无法实现现场的快速检测，尤其对农村或者发生疫情等条件艰苦的地区所发生的疫情难以发挥其优势。基于上述方法用于检测通用型腺病毒的报道已有很多，但用于分型的检测方法很少，目前还没有等温扩增检测3型人腺病毒的方法被报道。由于现存HAdV-3病毒检测方法的不足以及HAdV-3病毒快速实地检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可在常温下快速检测HAdV-3病毒的扩增方法非常有必要。重组酶介导扩增技术(Recombinase-aidedamplificationassay，RAA)是一种新型恒温核酸扩增检测技术。反应体系由大肠杆菌重组酶UvsX、单链结合蛋白、DNA聚合酶、缓冲液等组分组成，反应在39-42℃恒温下30min即可完成。在以往的RAA研究中，RAA检测技术的一个主要缺点是它们不包含内参。内参是存在于同一样品管中的非靶DNA序列，它与靶序列同时被扩增。在没有内参的RAA反应中，阴性反应(没有带或无信号)可能意味着反应中没有靶序列。但是，这也可能意味着由于温度不当、RAA反应体系混合物不正确、DNA聚合酶活性差或样品基质中存在抑制物质，从而使反应受到了抑制，而导致了假阴性结果。相反，在含有内参的RAA反应中，即使没有靶序列，也应该始终产生控制信号。本专利技术基于RAA技术，在反应体系中加入了内参，实现对反应体系及反应过程进行监测，进一步确保了检测结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测结果准确、无假阴性的灵敏、特异、快速的检测3型腺病毒的方法。为实现上述目的，专利技术人根据HAdV-3病毒基因组序列，寻找同源性高的保守序列，设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针。经过对比和筛选，本专利技术首先提供一条用于检测3型人腺病毒的靶序列，其具有SEQIDNO.6所示的序列或其特异性片段。其在GenBank登录号EF564601.1公开的序列第18764-18959bp位。专利技术人在HAdV-3病毒基因组序列间，根据GC含量在40％-60％之间、没有长的同序列的碱基、尽量没有正向/反向重复序列、回文序列等的原则，寻找高度保守序列作为目标区域；选择好区域后，再根据引物长度为30-35bp、5’端(3-5bp)避免出现重复G、GC含量不要大于70％或小于30％、引物间避免形成二级结构、引物二聚体等原则设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对；又根据探针长度一般为46-52个碱基、5’端到THF位点至少要30个碱基、THF位点到3’端至少要15个碱基的原则设计特异性靶探针；为避免出现假阴性，专利技术人进一步设计了一条内参探针。经过对比和筛选，本专利技术首先提供一条用于检测3型腺病毒的靶序列，其具有SEQIDNO.6所示的序列或其特异性片段。根据上述靶序列精心设计了特异性引物对和靶探针，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示。该专利技术的探针和引物适用检测HAdV-3。本专利技术探针类型为exo探针，5’标记荧光基团，3’标记淬灭基团。进一步地，本专利技术设计的内参探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。该内参探针类型为exo探针，5’标记与靶探针荧光颜色不同的荧光基团，3’标记淬灭基团。本专利技术提供了所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测3型腺病毒中的应用。具体地，本专利技术提供了适用于等温核酸扩增技术检测3型腺病毒的引物探针组合，该组合含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。优选地，本专利技术的引物探针组合还含有一条内参DNA和一条内参探针，所述内参DNA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了所述引物探针组合在制备快速检测3型腺病毒的试剂盒中的应用。进一步，本专利技术提供了含有所述引物探针组合的快速检测3型腺病毒的试剂盒。本专利技术实施例中，本专利技术提供的快速检测3型腺病毒的试剂盒含有等温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：该体系中，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA、VIC。本专利技术的试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品DNA和内参DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为35-45℃，优选39℃，扩增检测时间为15-20min，优选20min。本专利技术提供了一种适用于等温核酸扩增方法检测目标生物的内参DNA，该内参DNA由非人类基因组DNA片段和检测目标生物的靶序列重组而成，所述目标生物的靶序列为所设计的特异性引物对扩增目标生物靶片段的序列，用非人类基因组序列替换靶序列中的靶探针结合区得到。本专利技术实施例所采用的内参DNA为专利技术人设计并制备的重组DNA，由植物病毒片段和靶标片段(本专利技术为HAdV-3片段)组成。重组DNA保留了本专利技术HAdV-3片段相同的引物序列(SEQIDNO.1-2)，且靶标片段上的其他序列作为主干，而只有与HAdV-3探针(S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测3型腺病毒的靶序列，其具有SEQ ID NO.6所示的序列或其特异性片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测3型腺病毒的靶序列，其具有SEQIDNO.6所示的序列或其特异性片段。2.权利要求1所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测3型腺病毒中的应用。3.适用于等温核酸扩增技术检测3型腺病毒的引物探针组合，其特征在于，含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，还含有一条内参DNA和内参探针，所述内参DNA为非人类基因组序列的重组DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。5.权利要求3或4所述引物探针组合在制备快速检测3型腺病毒的试剂盒中的应用。6.含有权利要求3或4所述引物探针组合的快速检测3型腺病毒的试剂盒。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，含有等温核酸扩增体系如下：8.如权利要求7所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马学军，申辛欣，王智宏，应清界，张益，王佶，李鑫娜，王瑞欢，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11