一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，特点是包括14种水产养殖动物病毒的LAMP检测引物组，特点是基因序列如SEQ ID NO.1～NO.56所示，还包括样品模板、10×反应缓冲液、MgSO4、dNTP、Bst DNA聚合酶和双蒸水，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低和无假阴性结果。

A High-throughput Quantitative Detection Kit for Aquaculture Animal Viruses

【技术实现步骤摘要】
一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒
本专利技术涉及一种致水产养殖动物病毒的快速检测试剂盒，尤其是涉及一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒。
技术介绍
危害水产养殖动物的病原性疾病主要有病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫性疾病等。其中病毒病由于其病原体微小，在宿主细胞内复制，所以难以采用药物进行控制，一旦爆发病毒病将损失惨重。水产养殖动物病毒病的主要特点是病毒病发病与品种和水温有关，病毒病难以用药物控制病毒性疾病不同于细菌性疾病，由于病毒不能自身增殖，必须依靠宿主细胞内的能量和物质增殖，是专性的细胞内寄生生物。因此可以治疗细菌性疾病的抗生素等药物对病毒性疾病基本没有作用。大多没有有效的药物治疗措施，主要是以预防为主。隔离和控制难度大，这些动物生活在水中，病毒以水体为媒介传播，一旦有个体发病很快都会感染，也很难控制。临床症状复杂多变、传染性强、传播速度快、死亡率高，严重危害水产养殖业，能够造成重大经济损失。目前，水产养殖动物病毒包括胰脏坏死病毒(Infectiouspancreaticnecrosisvirus，IPNV)、桃拉病毒(Taurasyndromevirus,TSV)、诺达病毒（Macrobrachiumrosenbergiinodavirus,MrNV)、大鲵虹彩病毒(Chinesegiantsalamanderiridovirus,CGSIV)、淋巴囊肿病毒（LymphosystisDiseaseVirusChina，LCDVcn）、锦锂疱疹病毒(Koiherpesvirus，KHV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)、鲤春病毒病(Springviraemiaofcarp，SVC)、斑节对虾杆状病毒(Penaeusmonodon-typebaeulovirus,MBV)、肝胰腺细小病毒状病毒（Hepatopancreaticparvovirus，HPV）、黄头病毒（Yellowheadvirus，YHV）、传染性皮下和造血组织坏死病毒（Infctioushypodernmmandhaematopoieticnecrosisvirus，IHHNV）、偷死野田村病毒(Covertmortalitynodavirus,CMNV)、白斑病毒（Whitespotsyndromevirus,WSSV）、极小病毒(ExtraSmallVirus,XSV)、病毒性神经坏死病（Viralnervousnecrosis，VNN）、传染性肌肉坏死病毒(Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV)等是引起水产养殖动物死亡非常重要的致病微生物。传播速度快，死亡率高，所以，早期快速检测非常重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，包括14种水产养殖动物病毒的LAMP检测引物组，其基因序列如下表1所示：表1。所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA1μL，2.5μL10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM的MgSO4，3.5μL浓度为10mM的dNTP，1μL浓度为8U/μlBstDNA聚合酶，1μLFIP/BIP引物组溶液，1μLF3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中所述的FIP/BIP引物组溶液分别为表1所述的胰脏坏死病毒、大鲵虹彩病毒、淋巴囊肿病毒、锦锂疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、鲤春病毒病、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒状病毒、黄头病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、偷死野田村病毒、白斑症病毒、极小病毒和病毒性神经坏死病的FIP/BIP引物组溶液，各引物终浓度均为40μM，所述的F3/B3引物组溶液分别为表1所述的胰脏坏死病毒、大鲵虹彩病毒、淋巴囊肿病毒、锦锂疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、鲤春病毒病、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒状病毒、黄头病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、偷死野田村病毒、白斑症病毒、极小病毒和病毒性神经坏死病的F3/B3引物组溶液，各引物终浓度均为5μM。所述的检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者SYBR-GreenI，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μM，氯化锰浓度为500μM；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μM，所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μL/孔，所述的SYBR-GreenI显色剂的添加量为5μL/孔。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒设计的引物特异强，可进行快速扩增，通过荧光染料根据双链DNA的多少来确定病原模板的量，从而达到定量检测，时间在2-3h就完成了整个检测，具有特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的优点。附图说明图1为14种水产养殖动物病毒LAMP特异性检测结果；其中注：A：胰脏坏死病毒检测结果；B：大鲵虹彩病毒检测结果；C：淋巴囊肿病毒检测结果；D：锦锂疱疹病毒检测结果；E：传染性脾肾坏死病毒检测结果；F：鲤春病毒病检测结果；G：斑节对虾杆状病毒检测结果；H：肝胰腺细小病毒状病毒检测结果；I：黄头病毒检测结果；J：传染性皮下及造血组织坏死病毒检测结果；K：偷死野田村病毒检测结果；L：白斑症病毒检测结果；M：极小病毒检测结果；N：病毒性神经坏死病检测结果；0：DNAMarker；1：胰脏坏死病毒；2：大鲵虹彩病毒；3：淋巴囊肿病毒；4：锦锂疱疹病毒；5：传染性脾肾坏死病毒；6：鲤春病毒病；7：斑节对虾杆状病毒；8：肝胰腺细小病毒状病毒；9：黄头病毒；10：传染性皮下及造血组织坏死病毒；11：偷死野田村病毒；12：白斑症病毒；13：极小病毒；14：病毒性神经坏死病；15：阴性对照；图2为14种水产养殖动物病毒LAMP灵敏度检测结果；其中注：A：胰脏坏死病毒检测结果；B：大鲵虹彩病毒检测结果；C：淋巴囊肿病毒检测结果；D：锦锂疱疹病毒检测结果；E：传染性脾肾坏死病毒检测结果；F：鲤春病毒病检测结果；G：斑节对虾杆状病毒检测结果；H：肝胰腺细小病毒状病毒检测结果；I：黄头病毒检测结果；J：传染性皮下及造血组织坏死病毒检测结果；K：偷死野田村病毒检测结果；L：白斑症病毒检测结果；M：极小病毒检测结果；N：病毒性神经坏死病检测结果；0：DNAMarker；1：阴性对照；8-2：分别为10倍浓度梯度稀释的质粒模板；图3为样品检测实例图，其中注：A为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果，B为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果；1：胰脏坏死病毒；2：大鲵虹彩病毒；3：淋巴囊肿病毒；4：锦锂疱疹病毒；5：传染性脾肾坏死病毒；6：鲤春病毒病；7：斑节对虾杆状病毒；8：肝胰腺细小病毒状病毒；9：黄头病毒；10：传染性皮下及造血组织坏死病毒；11：偷死野田村病毒；12：白斑症病毒；13：极小病毒；14：病毒性神经坏死病；15：阴性对照。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：包括14种水产养殖动物病毒的LAMP检测引物组，其基因序列如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：包括14种水产养殖动物病毒的LAMP检测引物组，其基因序列如下表所示：。2.根据权利要求1所述的一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA1μL，2.5μL10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM的MgSO4，3.5μL浓度为10mM的dNTP，1μL浓度为8U/μlBstDNA聚合酶，1μLFIP/BIP引物组溶液，1μLF3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中所述的FIP/BIP引物组溶液分别为权利要求1所述的胰脏坏死病毒、大鲵虹彩病毒、淋巴囊肿病毒、锦锂疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、鲤春病毒病、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒状病毒、黄头病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、偷死野田村病毒、白斑症病毒、极小病毒和病毒性神经...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏秀榕，周君，芦晨阳，韩姣姣，李妍妍，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33