一种检测猪肝中戊肝病毒的方法技术

本申请提供了一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，具体步骤为：取猪肝样品1～2g并剪碎，加入RNaseOUT，然后加入MS2过程控制对照和TRIZOL溶液，均质器均质；吸取上清，离心，加入三氯甲烷，震荡混匀后吸取上清液，提取病毒RNA；使用75％酒精对RNA提取物进行处理离心、烘干，加入水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测。本发明专利技术提供的方法的回收效率高于本领域已有方法；PCR抑制剂去除效果较PCR抑制剂去除试剂盒好，检测所用引物及探针为自行设计，灵敏度高。

A Method for Detecting Hepatitis E Virus in Porcine Liver

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪肝中戊肝病毒的方法
本专利技术涉及病毒学
，尤其是涉及一种检测猪肝中戊肝病毒的方法。
技术介绍
戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是引起人类急性肝炎的主要病原体之一，近年来越来越受到国际社会的关注。HEV的分子结构是单链无包膜RNA病毒，直径27-34nm，属肝炎病毒科正戊肝病毒属，基因组全长6.6-7.3kb左右，包含3个开放阅读框(ORF1-3)，ORF1编码与病毒转录、复制相关的非结构蛋白，ORF2编码病毒衣壳蛋白，ORF3编码一种小分子磷蛋白，与细胞骨架和HEV的特异性免疫反应有关。在亚洲和非洲一些发展中国家表现为流行趋势，发达国家则表现为散发，而我国是该病毒的主要流行国家之一。HEV可分为五个基因型(I～V)，其中：Ⅰ型和Ⅱ型HEV仅感染人类，在人群中传播可造成戊肝大流行，Ⅲ型和Ⅳ型HEV是人畜共患，其自然宿主包括野猪、家猪和鹿等多种哺乳动物，多引起急性散发性戊肝，Ⅴ型仅发现于禽类。HEV可通过粪-口途径传播，包括因粪便污染生活用水而造成的水源传播，以及摄入感染HEV的动物内脏或肉制品等食源性传播[9]。已有证据表明生食或食入未煮熟的猪肝可引起HEV感染。HEV严重影响到了人们的身体健康，因此不仅仅要在生活中注意，及时隔离治疗，从而有效的防止传播；更需要建立一种快速有效的食品中HEV的检测方法，来检测食品中是否存在HEV，从源头上减少含有HEV的食物进入市场，保障食品安全。目前检测HEV的方法主要有免疫学检测和核酸检测。免疫学检测包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法和胶体金层析法。免疫学检测法有影响因素复杂，操作步骤要求严格，重复性差，所需时间长，价格昂贵等缺陷。核酸检测包括逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)、反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)和转录介导的扩增技术(TMA)。HEV核酸检测是急性戊肝和慢性戊肝诊断的“金标准”，该方法特异性强、灵敏度高，但是由于RNA检测具有操作复杂、成本高、易污染等特点，一定程度上限制了其广泛应用。德国科学家KathrinSzabo建立了食品中HEV的分离检测方法。该方法使用TRIZOL溶液，获得了最高的细胞破裂效率，同时也抑制了猪肝中相应的酶的活性，利用三氯甲烷进行纯化，提取出的RNA采用反转录荧光PCR方法进行检测。但是该方法提取产物回收率偏低且PCR抑制剂过多，导致PCR结果出现假阴性。我国是HEV的流行国家之一，主要流行基因型为人畜共患型——HEV4，该病毒主要通过粪口途径传播。目前对于粪便和血清中戊肝病毒的检测方法较多，而对食品中戊肝病毒的检测方法较少，这主要是由于食品中的复杂基质会影响PCR检测，因此，如何进行食品样本的前处理，提高病毒提取效率，降低复杂基质的影响是解决问题的关键，同时也要对猪肝中戊肝病毒含量进行分析。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种检测猪肝中戊肝病毒的方法。本专利技术的技术方案如下：一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，具体步骤如下：(1)取猪肝样品1～2g并剪碎，置于均质袋中，加入2～5μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；(3)洗脱提取到的病毒RNA中的PCR抑制剂，优选的，使用75％酒精对RNA提取物进行处理，具体方法为在50μLRNA提取物中加入1ml酒精，12000rpm离心10-15min后，弃去上清，重复上述步骤一次后，置于真空烘干箱内50℃烘干20min，加入50μL水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测；(4)另取步骤(3)的5μL终产物，加入1μLHEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。除样品外，分别设立阳性对照、阴性对照和水对照，其中：PCR反应体系50μL，其中MS2预混液35μL，酶混合液5μL，模板RNA为10μL；PCR反应条件：42℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后三个温度时间做44个循环。标准曲线制作方法为：取10μL的MS2过程控制对照，95℃加热灭活后冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，做3个梯度稀释，共4个浓度，加入到PCR反应体系后，进行荧光反转录PCR，制作标准曲线。所述采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测中，上游引物：GGTGGTTTCTGGGGTGAC；下游引物：AGGGGTTGGTTGGATGAA；探针：FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-MGB；PCR总反应体系为50μL，其中2×ReactionMix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水9.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为10.0μL；PCR反应条件为：50℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后面三个温度时间做44个循环。由于猪肝中存在大量的酶及无机物，在RNA提取过程中并不能将其彻底清除，这些残留物会对荧光反转录PCR产生抑制作用，导致结果出现假阴性，因此需设立外加控制对照，确定抑制剂对PCR的影响；所述外加控制对照设立方法为：分别在每5μLRNA提取物中加入1ul阳性对照样本，另外在5μL纯水中加入1μL阳性样本，进行荧光反转录PCR；PCR总反应体系为51μL，其中2×ReactionMix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水14.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为5.0μL，阳性RNA为1.0μL。回收率的计算公式为：肝脏中MS2回＝{{SQcopies/μL×50μL×1g/[(1g/7mL)×140μL}/(1copiy/μl×10μL)〕}×100％结果判定方法：外加控制对照结果判定：Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，表明结果有效。结果判定标准：在满足水对照和阴性对照Ct值>40、阳性对照Ct值<35和过程控制对照MS2的回收率≥1％的条件下，样本Ct值<35，结果判断为阳性；35≤Ct值≤40，需重新检测；Ct值>40，需参考过程控制对照，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，则判定为阴性，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＞2，说明抑制剂影响过大，需重新提取，或想办法去除抑制剂。过程控制有效性判断标准：样本中添加的MS2回收率≥1％，扩增效率E在90-110％之间，标准曲线斜率S在-3.1～-3.6之间，表明实验结果有效，可忽略提取过程中RNA的损失；若回收率小于1％需重新提取病毒RNA。本专利技术有益的技术效果在于：(1)本专利技术提供的方法的回收效率高于本领域已本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)取猪肝样品1～2g并剪碎，置于均质袋中，加入2～5μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；(3)洗脱提取到的病毒RNA中的PCR抑制剂，置于真空烘干箱内50℃烘干，加入50μL水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测；(4)另取步骤(3)的5μL终产物，加入1μL HEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)取猪肝样品1～2g并剪碎，置于均质袋中，加入2～5μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；(3)洗脱提取到的病毒RNA中的PCR抑制剂，置于真空烘干箱内50℃烘干，加入50μL水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测；(4)另取步骤(3)的5μL终产物，加入1μLHEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于除样品外，分别设立阳性对照、阴性对照和水对照，其中：PCR反应体系50μL，其中MS2预混液35μL，酶混合液5μL，模板RNA为10μL；PCR反应条件：42℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后三个温度时间做44个循环。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于标准曲线制作方法为：取10μL的MS2过程控制对照，95℃加热灭活后冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，做3个梯度稀释，共4个浓度，加入到PCR反应体系后，进行荧光反转录PCR，制作标准曲线。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测中，上游引物：GGTGGTTTCTGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳慧，李凤琴，江涛，李楠，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，
类型：发明
国别省市：北京,11