一种碱性磷酸酶的制备方法技术

本申请提供一种碱性磷酸酶的制备方法，包括使用干燥工艺

【技术实现步骤摘要】
一种碱性磷酸酶的制备方法


[0001]本申请涉及一种碱性磷酸酶的制备方法，属于生物化学领域
。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶
(alkaline phosphatase,ALP)
是一种普遍存在于各类生物中的膜结合糖蛋白，由一组同工酶组成
。
在乳品行业中常用于检测巴氏杀菌乳中微生物被杀灭的程度，其原理是：经过
63℃,30min
，或
72℃,10
～
15s
加热后可以使碱性磷酸酶钝化失活
,
而乳液中的无芽孢致病微生物则全部被杀死
。
一方面，市场上的碱性磷酸酶标准品大多来源于大肠杆菌
、
动物组织等
。
由于不同来源的碱性磷酸酶的结构和性质有所不同，使用非奶源的碱性磷酸酶标准品来鉴定巴氏杀菌乳必然会影响结果的准确性
。
因此，有必要制备一种良好的来源于乳基质的碱性磷酸酶标准品，从而更准确地鉴定巴氏杀菌乳
。
[0003]另一方面，制取碱性磷酸酶是已知的技术，由于固体更容易保存和运输，因此，人们也经常将碱性磷酸酶溶液干燥为固体形式，但干燥过程对碱性磷酸酶的活性及回收率影响较大，因此，有必要改良干燥工艺，以便获得高活性
、
高回收率的固体碱性磷酸酶
。
另外，如何在干燥前维持碱性磷酸酶的高活性
、
避免酶活性过快丧失也是需要考虑的改良因素
。

技术实现思路

[0004]本申请至少包含三方面的创新：
[0005]第一，探索出了一套能制备出高活性
、
高收率的碱性磷酸酶的干燥工艺
。
[0006]第二，首次发现在碱性磷酸酶的溶液中加入“甘露醇
+
钙离子”，能高效维持或促进碱性磷酸酶的活性
。
[0007]第三，首次制备出了奶源的性质优良的碱性磷酸酶标准品
。
[0008]为了实现上述目的，本申请提供一种碱性磷酸酶的制备方法，包括使用干燥工艺，即将碱性磷酸酶溶液依次在
90
～
100mTorr
‑
42
～
‑
38℃、400
～
600mTorr
‑
27
～
‑
23℃、4
～
6Torr
‑2～
2℃、8
～
12Torr 8
～
12℃
的环境下保留
1h、7h、3h
和
2h。
[0009]为了在制备碱性磷酸酶的过程中最大程度地保持其活性，有必要摸索出一套完整流程的最优组合
。
因此，在一些实施方式中，在干燥工艺之前，在碱性磷酸酶溶液中加入甘露醇和钙离子试剂
。
[0010]在一些实施方式中，钙离子试剂为氯化钙
。
[0011]在一些实施方式中，甘露醇的添加量为
2.5
％
、
氯化钙的添加量为
63mmol/L。
[0012]在一些实施方式中，在干燥工艺之后，将干燥后的成分制成片剂
。
[0013]在一些实施方式中，片剂中的碱性磷酸酶的活力为
875
±
26
μ
U/
片
。
[0014]为了能够准确检测巴氏杀菌乳中微生物的杀灭程度，本申请还提供一种用于检测巴氏杀菌乳微生物杀灭程度的碱性磷酸酶标准品的制备方法
。
因此，在一些实施方式中，碱性磷酸酶源于生鲜乳
。
附图说明
[0015]图1本方法制备的碱性磷酸酶标准品活性比市售产品更稳定
。
具体实施方式
[0016]下面参考附图来说明本申请的实施例
。
在本申请的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合
。
应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本申请无关的
、
本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述
。
[0017]实施例1本申请的干燥工艺能高效地保持碱性磷酸酶的活性
[0018]取市售碱性磷酸酶各
0.035g(850
μ
U)
，用
2.5mL
阴性牛奶溶解，获得碱性磷酸酶活性为
340mU/L
的牛奶样品，采用不同的干燥方法，具体如下：
[0019]参比方法
1(
现有干燥方法
)
：在
‑
50℃
的冷冻温度下抽真空后，在
‑
10℃
下进行
12
小时的主干燥，于
20℃
下进行
24
小时的再干燥
。
[0020]本申请的干燥工艺：依次在
96mTorr
‑
40℃、480mTorr
‑
25℃、5Torr0℃、10Torr 10℃
的环境下保留
1h、7h、3h
和
2h。
[0021]采用
ISO 22160
‑
2007
方法进行检测，每个样品检测5个平行，结果取平均值
。
检测结果见表
1。
[0022]表1不同干燥方法对碱性磷酸酶活性的影响
[0023][0024]由表1可见，与现有的干燥方法相比，采用本申请的干燥工艺获得的碱性磷酸酶保持了较高的活性，取得了显著更高的回收率
。
[0025]实施例2甘露醇
+Ca
2+
能高效保持碱性磷酸酶的活性
[0026]专利技术人此前的研究表明，有些离子对碱性磷酸酶的活性具有保持作用
(
如
Mg
2+
)
，而有些离子对碱性磷酸酶的活性有抑制作用
(
如
Cu
2+
)
，并无统一的规律，尤其是关于
Ca
2+
是否具有保持碱性磷酸酶活性的作用在本专利申请前未见任何报道
。
[0027]本实施例尝试采用氯化镁
、
氯化钙
、
和氯化锌作为碱性磷酸酶的活性保持剂
。
主要实验步骤为：取市售碱性磷酸酶各
0.035g(850
μ
U)
，用
2.5mL
阴性牛奶溶解，获得碱性磷酸酶活性为
340mU/L
的牛奶样品，分别加入浓度不同的碱性磷酸酶的活性保持剂组合，室温下放置2天后，采用
ISO 22160
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种碱性磷酸酶的干燥方法，其特征在于，将碱性磷酸酶溶液依次在
90
～
100mTorr
‑
42
～
‑
38℃、400
～
600mTorr
‑
27
～
‑
23℃、4
～
6Torr
‑2～
2℃、8
～
12Torr 8
～
12℃
的环境下保留
1h、7h、3h
和
2h。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶源于生鲜乳
。3.
一种碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，包括使用一种干燥工艺，即将碱性磷酸酶溶液依次在
90
～
100mTorr
‑
42
～
‑
38℃、400
～
600mTorr
‑
27
～
‑
23℃、4
～
6Torr
‑2～
2℃、8
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨大进，刘龙飞，王慧，赵三军，李慧，王丹，卜庆婧，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，
类型：发明
国别省市：