一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物、探针、试剂盒及方法。本发明专利技术提供的检测引物和探针能够特异性检测诺如病毒GⅠ基因组。本发明专利技术与现有技术相比特异性好、灵敏度高；且具备更好的检测时效性，可有效降低检测所需要的时间，对于食品样本，12h即可完成样品检测，对于腹泻病人粪便样本，30min即可完成检测；同时检测方法结合了侧向流动试纸条，能够使检测过程简单、结果更加容易判定，仅需提取RNA后进行等温核酸扩增即可观察结果；此外，检测流程操作简单，对检测人员的技术要求不高，不需要复杂、高成本的仪器设备，适用于现场检测。适用于现场检测。适用于现场检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物、探针、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于诺如病毒基因分子学检测
，具体涉及一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物、探针、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要病原体之一，可感染所有年龄阶段的人群。美国和欧洲50％(范围：36％～59％)以上的急性胃肠炎暴发由诺如病毒所致。世界卫生组织(WHO)估计诺如病毒每年导致6.85亿例腹泻病例，约212489人死于诺如病毒感染，其中99％发生于发展中国家。2014年Ahmed SM等发表的一篇系统综述和Meta分析纳入了48个国家报道的175篇文献，结果发现1/5的急性胃肠炎病例是由诺如病毒感染引起。我国是全球15个腹泻病高负担国家之一，腹泻病例中有11.6％检出诺如病毒，因此诺如病毒对我国人群健康的影响不容忽视。2012年以来，诺如病毒已成为我国非细菌性感染性腹泻病暴发的优势病原体(60％～96％)。
[0003]诺如病毒基因组结构为单股、正链、无包膜RNA病毒，病毒粒子为二十面体结构，直径约27～40nm。病毒基因组全长约7.5～7.7kb，包含3个开放式阅读框(open reading frame,ORFs)，其中ORF1编码一个多聚蛋白，裂解后形成7个非结构蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶、NTPase等，ORF2编码病毒的主要结构蛋白(VP1)
‑
衣壳蛋白，ORF3编码次要结构蛋白(VP2)。根据诺如病毒基因组特征及系统进化分析，诺如病毒至少被分为6个基因群(genogroup，GⅠ～G
Ⅵ
)，其中GⅠ和GⅡ是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群。
[0004]目前，诺如病毒主要检测方法包括电镜法、免疫学检测方法和基因检测方法。电镜法的检测灵敏度较差并且需要依靠昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，因此极大地限制了其推广使用。免疫学检测方法操作简单，方法的特异性较好，但是检测方法的敏感性较差，假阴性现象较为普遍，也严重影响了方法的推广使用。RT
‑
PCR或实时荧光RT
‑
qPCR方法是目前检测诺如病毒的主要方法。但是，RT
‑
PCR和荧光RT
‑
qPCR需要昂贵的仪器设备，操作费时费力，并且不能满足缺乏荧光PCR仪器的基层单位的需求，同时也不能满足现场的快速筛检的需求，急需发展一种简单快速、适于现场使用的诺如病毒检测技术。

技术实现思路

[0005]针对现存的上述问题，本申请提出了一种结合侧向流动试纸条检测诺如病毒GⅠ基因组的引物、探针、试剂盒及方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速简便、不需要昂贵的仪器设备等特点，能够实现对诺如病毒GⅠ基因组的快速筛查及快速鉴定。
[0006]本专利技术提供如下技术方案。
[0007]在第一个方面，本专利技术提供一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物，包含上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为：
[0008]5’‑
CCG AAT TTG TAA ATG ATG ATG GCG TCT AAG
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0009]所述下游引物的核苷酸序列为：
[0010]5’‑
BIOTIN
‑
GTC CTA ATT GCA AAT CAA ACA AAA TAT CWC
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0011]在第二个方面，本专利技术提供一种检测诺如病毒GⅠ基因组的探针，所述探针的核苷酸序列为：
[0012]5’‑
FAM
‑
TAA TAT GAT TGA TCC CTG GAT TGT TAA TAA TT(THF)TGT CCA GTC ACC TCA
‑
SPACER
‑
C3
‑3’
(SEQ ID NO.3)。
[0013]在第三个方面，本专利技术提供检测诺如病毒GⅠ基因组的等温重组酶聚合酶反应试剂盒，其包括含有上述引物和探针以及等温重组酶聚合酶反应组分构建的扩增反应体系。
[0014]在一个实施方案中，所述等温重组酶聚合酶反应体系以50μL计，包括40.90μL的等温重组酶聚合酶反应预混液A(北京美正生物科技有限公司，货号LR78403R)，2.5μL的等温重组酶聚合酶反应预混液B(北京美正生物科技有限公司，货号LR78403R)，2.0μL权利要求1所述的上游引物，2.0μL权利要求1所述的下游引物，0.6μL权利要求2所述的探针，2.0μL的模板RNA。
[0015]在第四个方面，本专利技术提供检测诺如病毒GⅠ基因组的非诊断目的的方法，包括以下步骤：
[0016]1)提取待测样本基因组RNA，所述样本来自于食品和环境样本；
[0017]2)对所述步骤1)提取的样本RNA并采用权利要求3所述的试剂盒形成等温重组酶聚合酶反应体系；
[0018]3)将所述步骤2)配制得到的所述等温重组酶聚合酶反应体系于42℃下反应12min；
[0019]4)侧向流动试纸条检测：所述步骤3)的等温重组酶聚合酶反应结束后，向反应管中加入150μL纯水，混合后，吸取40μL反应产物，点在侧向流动试纸条的加样处，在5min内观测结果，确定被检测样本中是否含有诺如病毒GⅠ基因组。
[0020]在一个实施方案中，所述步骤2)中构建所述等温重组酶聚合酶反应体系时，首先加入所述40.90μL的等温重组酶聚合酶反应预混液A(北京美正生物科技有限公司，货号LR78403R)至PCR反应管中；然后再加入2.0μL的上游引物、2.0μL的下游引物、0.6μL的探针以及2.0μL的所述模板RNA；最后，加入2.5μL的所述等温重组酶聚合酶反应预混液B(北京美正生物科技有限公司，货号LR78403R)至PCR反应管中。
[0021]在一个实施方案中，若所述侧向流动试纸条的C区对照线出现条带且T区测试线未出现条带，则代表检测结果为阴性，即被检测样品中不含有诺如病毒GⅠ基因组；若所述侧向流动试纸条的C区对照线出现条带且T区测试线出现条带，则代表检测结果为阳性，即被检测样品中含有诺如病毒GⅠ基因组。
[0022]在第五个方面，本专利技术提供上述引物或探针在制备预防和/或治疗和/或诊断诺如病毒GⅠ相关疾病药物中的应用。
[0023]本专利技术的有益效果为：
[0024]1、本专利技术提供的引物和探针特异性好：可以特异性鉴定诺如病毒GⅠ基因组，与诺如病毒GⅡ基因组、札如病毒和甲肝病毒不发生交叉反应；灵敏度高：可达到8.1
×
102基因拷贝/500mL包装饮用水。
[0025]2、本专利技术提供的检测引物、探针、试剂盒及方法与现有技术相比具有更好的检测时效性，可有效降低检测所需要的时间，对于食品样本，12小时即可完成样品检测，对于腹
泻病人粪便样本，30min即可完成检测；同时检测方法结合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测诺如病毒GⅠ基因组的引物，包含上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列为：5
’‑
CCG AAT TTG TAA ATG ATG ATG GCG TCT AAG
‑3’
；所述下游引物的核苷酸序列为：5
’‑
BIOTIN
‑
GTC CTA ATT GCA AAT CAA ACA AAA TAT CWC
‑3’
。2.一种检测诺如病毒GⅠ基因组的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：5
’‑
FAM
‑
TAA TAT GAT TGA TCC CTG GAT TGT TAA TAA TT(THF)TGT CCA GTC ACC TCA
‑
SPACER
‑
C3
‑3’
。3.检测诺如病毒GⅠ基因组的等温重组酶聚合酶反应试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针以及等温重组酶聚合酶反应组分构建的扩增反应体系。4.根据权利要求3所述的等温重组酶聚合酶反应试剂盒，其特征在于，所述等温重组酶聚合酶反应体系以50μL计，包括40.90μL的等温重组酶聚合酶反应预混液A，2.5μL的等温重组酶聚合酶反应预混液B，2.0μL权利要求1所述的上游引物，2.0μL权利要求1所述的下游引物，0.6μL权利要求2所述的探针，2.0μL的模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：江涛，李凤琴，徐进，董银苹，李楠，王佳慧，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，
类型：发明
国别省市：