一种菜豆普通花叶病毒的RT-qPCR检测试剂盒及检测方法技术

本申请公开了一种菜豆普通花叶病毒RT

【技术实现步骤摘要】
一种菜豆普通花叶病毒的RT
‑
qPCR检测试剂盒及检测方法


[0001]本申请属于生物
，涉及一种菜豆病毒病的检测方法，主要针对菜豆普通花叶病毒的检测，以及检测该病毒的试剂盒。

技术介绍

[0002]菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)是马铃薯病毒目(Patatavirales)马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的成员之一，是一种在豆科植物上广泛发生的植物病毒，是菜豆上最主要的病毒病害之一，目前在全世界均有分布。病毒粒体线状，长约750nm。菜豆植株在幼苗至成株期均可感染菜豆普通花叶病毒，受BCMV侵染后，植株表现为叶脉褪绿、叶片不均匀褪绿、叶面凹凸不平、叶皱缩、叶片边缘向下弯曲等，严重时叶片扭曲畸形、植株矮缩、生长点坏死、开花迟缓、落花严重，受病毒感染的植株结荚少且荚果小，病荚有时覆盖深绿色的斑点，成熟期比健荚推迟。大田中菜豆的发病率可达100％，产量损失可达35％～98％。BCMV传播途径多样，可由豌豆蚜、蚕豆蚜和桃蚜等多种蚜虫以非持久性方式传毒；也可由汁液接触、种子和花粉传播，其中，种子带毒率相对较高，甚至高达83％。
[0003]菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是最重要的食用豆类作物之一，含有大量的蛋白质、纤维、碳水化合物、维生素和矿物质，几乎占全球食用豆类消耗中的一半。随着我国豆类面积的不断扩大，豆类上的病毒病害发生日渐严重，豆类病毒病已经成为制约豆类产量和品质发展的一个重要因素。
[0004]目前，对BCMV的常规检测手段主要包括生物学检测、电镜观察及免疫学方法等。实时荧光PCR技术具有快速、交叉污染较少、灵敏度高的特点，建立菜豆普通花叶病毒RT
‑
qPCR检测方法，可为菜豆病毒病害的诊断、检测、抗病育种和综合防治提供技术支持。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的问题，本专利技术提供一种菜豆普通花叶病RT
‑
qPCR检测试剂盒，检测病原为菜豆普通花叶病毒。
[0006]本申请又一目的提供一种菜豆普通花叶病毒RT
‑
qPCR检测方法，适合种苗、植株、繁殖材料中菜豆普通花叶病毒的测定。
[0007]为了实现上述目的，本申请所采用的技术方案如下：
[0008]一种菜豆普通花叶病毒的RT
‑
qPCR检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括以下组分：
[0009]RT
‑
qPCR缓冲液，其为2
×
RT
‑
qPCR缓冲液，容量为100
‑
1000μL；
[0010]EnzyMix，4
‑
100μL；Ex Taq HS，4
‑
100μL；
[0011]浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒上游引物4
‑
100μL；浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒下游引物4
‑
100μL；浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒探针4
‑
100μL；
[0012]无DNA/RNA酶去离子水50
‑
1000μL；菜豆普通花叶病毒阳性对照10
‑
100μL；
[0013]RT
‑
qPCR扩增引物和探针为：
[0014]菜豆普通花叶病毒上游引物BCMV
‑
F为：5
′‑
TCGCTGAATAGTTTCA TATAG
‑3′
；
[0015]菜豆普通花叶病毒下游引物BCMV
‑
R为：
[0016]5′‑
CGGCTTACTCATAAACATAA
‑3′
；
[0017]菜豆普通花叶病毒探针BCMV
‑
P为：5
′‑
TGGACCAACCACACTATCA CAATAG
‑3′
。
[0018]一种利用上述所述RT
‑
qPCR试剂盒检测菜豆普通花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0019]1)待测样品RNA提取；
[0020]2)RT
‑
qPCR反应体系20μL，其中：2
×
one step RT
‑
qPCR Buffer 10μL，浓度5U/μL的Ex Taq HS为0.4μL，EnzyMix为0.4μL；
[0021]浓度10μmol/L的菜豆普通花叶病毒上下游引物BCMV
‑
F、BCMV
‑
R各0.4μL，浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒探针BCMV
‑
P为1μL；
[0022]总RNA模板1
‑
5μL；无DNA/RNA酶去离子水补足至20μL；
[0023]3)RT
‑
qPCR反应条件：42℃15min；95℃3min；95℃10s；60℃1min，经40个循环，每个循环延伸结束时采集荧光信号；当使用不同的商业TaqMan RT
‑
qPCR试剂盒时，RT
‑
qPCR参数可能需要调整，选用反应条件值存在偏差可能会导致假阳性或假阴性的结果。
[0024]4)分析判断：采用实时荧光PCR仪进行扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的Ct值判断结果，荧光RT
‑
PCR反应呈阳性，则待测样品中含有菜豆普通花叶病毒核酸。
[0025]本专利技术根据菜豆普通花叶病毒的多聚蛋白基因设计了检测引物和探针，其目标序列如下：
[0026]TCGCTGAATAGTTTCATATAGTAATCTTTTATGTTCTCTTTAGTTTC AGTGTGGTTCTACCACCTTTGTGTTACTATTGTGATAGTGTGGTTGGT CCACCAACATATTGTGAGTACTTTATGTTTATGAGTAAGCCG；并建立了实时荧光RT
‑
PCR反应体系和反应程序。
[0027]本申请的有益效果是：本专利技术能检测菜豆普通花叶病毒，检测周期短。利用该检测方法能特异扩增出菜豆普通花叶病毒的基因片段，检测的稳定性好，特异性强，灵敏度高，且菜豆普通花叶病毒检测与烟草花叶病毒、菜豆黄花叶病毒、苜蓿花叶病毒等无交叉，可用于菜豆普通花叶病毒的早期诊断和田间病原调查，实现了菜豆普通花叶病毒的快速准确检测，有利于摸清田间病害发生状况，可为蔬菜作物健康生产提供有效的监控手段。
附图说明
[0028]图1为本申请RT
‑
qPCR扩增曲线，图中：
[0029]1：菜豆普通花叶病毒BCMV；2：烟草花叶病毒TMV；3：菜豆黄花叶病毒BYMV；4：苜蓿花叶病毒AMV；5：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菜豆普通花叶病毒的RT
‑
qPCR检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括以下组分：RT
‑
qPCR缓冲液，其为2
×
RT
‑
qPCR缓冲液，容量为100
‑
1000μL；EnzyMix，4
‑
100μL；Ex Taq HS，4
‑
100μL；浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒上游引物4
‑
100μL；浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒下游引物4
‑
100μL；浓度为10μmol/L的菜豆普通花叶病毒探针4
‑
100μL；无DNA/RNA酶去离子水50
‑
1000μL；菜豆普通花叶病毒阳性对照10
‑
100μL；RT
‑
qPCR扩增引物和探针为：菜豆普通花叶病毒上游引物BCMV
‑
F为：5
′‑
TCGCTGAATAGTTTCA TATAG
‑3′
；菜豆普通花叶病毒下游引物BCMV
‑
R为：5
′‑
CGGCTTACTCATAAAC ATAA
‑3′
；菜豆普通花叶病毒探针BCMV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞博，洪大伟，
申请(专利权)人：西藏自治区农牧科学院农业研究所，
类型：发明
国别省市：