新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，所述引物组包括1对外引物(DAAV

【技术实现步骤摘要】
新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒


[0001]本专利技术属于动物传染病学检测领域，具体涉及一种新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。

技术介绍

[0002]根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的最新分类，细小病毒科(Family:Parvoviridae)下设三个病毒亚科(Sub Family)：Densovirinae(浓病毒亚科)、Hamaparvovirinae(中文名称待定)和Parvovirinae(细小病毒亚科)。Parvovirinae(细小病毒亚科)下设10个病毒属(genera)，其中腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)属于Parvovirinae(细小病毒亚科)下设的Genus:Dependoparvovirus(依赖性细小病毒属)。
[0003]腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)属于细小病毒亚科依赖性细小病毒属。AAV为无包膜，正二十面体，直径20～26nm，基因组大小为4.7kb的单链DNA。AAV本身为复制缺陷病毒，只有在辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒等)作用下才能复制增殖。它有两个大的开放阅读框(ORF)，末端重复序列(ITR)位于开放阅读框的两侧。左侧Rep编码的非结构性蛋白，对病毒的包装和复制起重要作用。右侧Cap编码的结构蛋白，负责病毒颗粒的整合、复制和装配。AAV不但能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞，在体内具有广泛的组织嗜性。
[0004]目前AAV可分为三个基因群，大部分都从哺乳动物中检测到。研究还发现，已发现超过150余种病毒变异体。我们在开展水禽疫病流行病毒学调查时，在福建鸭群中发现存在新型鸭源腺相关病毒(duck adeno
‑
associated virus，DAAV)感染，对其(命名为DAAV
‑
FJ株)的Cap基因全长克隆发现，DAAV
‑
FJ株Cap基因全长为2217bp，和DAAV/G003
‑
20/Australia/2020(GenBank登录号为MW380871)核苷酸同源性为72.4％，氨基酸同源性为62.7％。
[0005]目前，关于新型鸭源腺相关病毒(DAAV)致病性的研究较少，致病机理等相关研究还未见涉及。所以，建立一种简单实用的检测方法对DAAV科学防控有着重要意义。
[0006]环介导等温扩增方法(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：
①
LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。
②
LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。
③
阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场
使用。目前，还未见针对新型鸭源腺相关病毒(DAAV)环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。应用该引物组可以特异性的检测新型鸭源腺相关病毒，为基层现场提供一种简便、快捷的检测新型鸭源腺相关病毒的方法。
[0008]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009]一种新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组，其由1对外引物(DAAV
‑
F3和DAAV
‑
B3)、1对内引物(DAAV
‑
FIP和DAAV
‑
BIP)和1组环引物(DAAV
‑
LF和DAAV
‑
LB)组成，上述引物序列如下：
[0010]DAAV
‑
F3：5
’‑
GGTTGGAGAATTTTGTGCGC
‑3’
，
[0011]DAAV
‑
B3：5
’‑
GTACGCCTTGTCGTGCTC
‑3’
，
[0012]DAAV
‑
FIP：
[0013]5’‑
ATGCTGCTGGTTAGGCTTTGGTTTCCGGTTGCCGAATTTGC
‑3’
，
[0014]DAAV
‑
BIP：
[0015]5’‑
AGCCGAGGTCTTGTTTTACCTGGCAGCGTTGACGGGTTCAC
‑3’
，
[0016]DAAV
‑
LF：5
’‑
GGGCTCCAGCCTCCAAAT
‑
3”，
[0017]DAAV
‑
LB：5
’‑
CTTGGTCCTTTTAACGGTCTTGAC
‑
3。
[0018]一种含所述引物组的新型鸭源腺相关病毒检测试剂盒。所述试剂盒包括：荧光目视检测试剂、2
×
反应缓冲液、所述的引物组、BstDNA聚合酶、超纯水。
[0019]所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0020]所述的2
×
反应缓冲液包括pH8.8 Tris
‑
HCl为40mM、KCl为20mM、MgSO4为16mM、(NH4)2SO4为20mM、Tween20为0.2wt.％、Betaine为1.6M、dNTPs mixture每种均为2.8mM。
[0021]所述的新型鸭源腺相关病毒检测试剂盒的LAMP反应体系25μL：2
×
反应液12.5μL、Bst DNA大片段聚合酶1μL、DAAV
‑
F3和DAAV
‑
B3(浓度为5pmol)各1μL、DAAV
‑
FIP和DAAV
‑
BIP(浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型鸭源腺相关病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物组由1对外引物DAAV
‑
F3和DAAV
‑
B3、1对内引物DAAV
‑
FIP和DAAV
‑
BIP和1组环引物DAAV
‑
LF和DAAV
‑
LB组成，上述引物序列如下：DAAV
‑
F3：5
’‑
GGTTGGAGAATTTTGTGCGC
‑3’
，DAAV
‑
B3：5
’‑
GTACGCCTTGTCGTGCTC
‑3’
，DAAV
‑
FIP：5
’‑
ATGCTGCTGGTTAGGCTTTGGTTTCCGGTTGCCGAATTTGC
‑3’
，DAAV
‑
BIP：5
’‑
AGCCGAGGTCTTGTTTTACCTGGCAGCGTTGACGGGTTCAC
‑3’<...

【专利技术属性】
技术研发人员：万春和，赵敏，付环茹，黄瑜，程龙飞，傅光华，陈红梅，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：