本发明专利技术提供了一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明专利技术所述的引物分子信标组合的特异性好、检测敏感性高，检出下限达到1拷贝；应用本发明专利技术的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济地检测猴痘病毒野生型及其变异株，并且还可以通过分子信标熔解曲线法对猴痘病毒野生型及其变异株进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关病原检测的要求。作中相关病原检测的要求。作中相关病原检测的要求。
【技术实现步骤摘要】
一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用
[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用。
技术介绍
[0002]目前，荧光定量PCR应用的探针主要是5
’
端
‑
报告荧光基团和3
’
端
‑
淬灭荧光基团，该方法是通过探针之间的无规则卷曲达到淬灭荧光的效果，然而该标记方法由于空间距离导致报告荧光基团和淬灭荧光基团之间无法达到零距离接触，从而无法实现零背景的荧光。
[0003]虽然，目前已经开发有超级淬灭探针(例如上海百力格生物技术有限公司)，在原先5
’‑
报告荧光基团和3
’‑
淬灭荧光基团的基础上在中间再加入BHQ淬灭基团，但是依然无法彻底达到零背景荧光的目的。百力格的对比研究表明：通过超级淬灭探针可以实现对背景荧光彻底淬灭，不仅可以增加检测体系的荧光值Rn值，还可以显著降低相同模板的Ct值，进而可以显著提高分子检测的灵敏度。
[0004]但是，加入两个荧光淬灭基团不但会增加检测体系的负荷，而且会增加试剂盒的生产成本，同时双淬灭荧光基团的设计存在一定的难度和失败的风险，从而增加了研发的难度、周期和成本。
[0005]猴痘是猴痘病毒感染引起的一种人兽共患病，猴痘病毒属于痘病毒科的一个子集，被称为正痘病毒属，是感染哺乳动物并引起脓疱的一系列病毒。猴痘主要通过密切接触传播和呼吸道传播，被病毒污染的物品也可能有传染性。根据以往新闻报道来看，人感染猴痘病例主要是接触携带病毒的动物被传染，皮肤伤口或者黏膜接触患病动物血液、体液也有可能被传染，比如较长时间共处同一个房间，也有可能通过呼吸道感染。
[0006]通过序列比对发现：猴痘病毒变异株带有56个SNPs和3个缺失，这些突变位点可以作为猴痘病毒野生型或者突变型的分子标识。通过溯源分析发现该变异株自2018年以来一直肆虐全球，成为危害社会的公共卫生安全隐患之一。
[0007]因此，对猴痘进行准确基因分型检测对于控制猴痘疫情具有至关重要的作用，虽然有将分子信标用于多重真菌检测的报道和专利，但是却没有将分子信标用于基因分型的报道。因此，开发设计一种高灵敏度的分子信标在猴痘病毒的基因分型检测中具有重要的应用前景。
技术实现思路
[0008]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用。本专利技术通过应用荧光定量PCR技术快速、准确且更加灵敏地对猴痘病毒的野生型和突变型进行检测并分型，具有检测敏感性高、特异性好，检出下限均可以达到1拷贝，具有高通量、低成本等特点。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；
[0011]特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0012]优选地，检测野生型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，检测突变型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0013]本专利技术在不改变原有探针的基础上，在探针的5
’
端加入3
’
端的一定数量的反向互补序列从而使解离的探针形成类似单链RNA的茎环结构，从而使报告荧光基团和淬灭荧光基团在空间结构上达到无限接近的程度，进而达到完全淬灭背景荧光的目的。
[0014]优选地，所述引物分子信标组合还包括分别特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标，所述内标基因为RNase P基因。
[0015]优选地，特异性扩增所述内标基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
[0016]优选地，检测所述内标基因的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
[0017]优选地，所述分子信标均带有荧光基团和淬灭基团，检测野生型猴痘病毒的分子信标、检测突变型猴痘病毒的分子信标和检测内标基因的分子信标的荧光基团均不同。
[0018]优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、Texas Red或LC RED460中任意一种或至少两种的组合。
[0019]优选地，所述淬灭荧光基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中任意一种或至少两种的组合。
[0020]第二方面，本专利技术提供一种检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一方面所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合。
[0021]本专利技术中，所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括PCR缓冲液、酶混合液和水。
[0022]第三方面，本专利技术提供一种第二方面所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
[0023](1)采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；
[0024](2)对步骤(1)中的PCR体系进行扩增检测；
[0025](3)根据步骤(2)中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原体感染情况。
[0026]优选地，所述PCR扩增体系包括酶混合液、上游引物、下游引物、野生型分子信标、突变型分子信标和模板。
[0027]本专利技术中，所述PCR扩增体系中包括热稳定且具备或者不具备5
’‑3’
外切酶活性的DNA聚合酶。
[0028]优选地，所述上游引物和下游引物的终浓度各自独立为100
‑
400nM，例如可以是100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM或400nM等。
[0029]优选地，所述野生型分子信标和突变型分子信标的终浓度各自独立为100
‑
400nM，例如可以是100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM或400nM等。
[0030]优选地，所述模板的终浓度为100‑
108拷贝，例如可以是100拷贝、101拷贝、102拷贝、103拷贝、104拷贝、105拷贝、106拷贝、107拷贝或108拷贝等。
[0031]优选地，所述扩增检测的反应条件为：预变性：94
‑
97℃、4
‑
5min；变性：94
‑
97℃、8
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12s，延伸58
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62℃，28
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32s，40
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45个循环；
[0032]熔解曲线程序本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，检测野生型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，检测突变型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。3.根据权利要求1或2所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述引物分子信标组合还包括分别特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标，所述内标基因为RNase P基因；优选地，特异性扩增所述内标基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；优选地，检测所述内标基因的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述分子信标均带有荧光基团和淬灭基团，检测野生型猴痘病毒的分子信标、检测突变型猴痘病毒的分子信标和检测内标基因的分子信标的荧光基团均不同；优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、Texas Red或LC RED460中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述淬灭荧光基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中任意一种或至少两种的组合。5.一种检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1
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4中任一项所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合。6.一种权利要求5所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：(1)采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；(2)对步骤(1)中的PCR体系进行扩增检测；(3)根据步骤(2)中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原体感染情况。7.根据权利要求6所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨文文，周凯月，陶维维，窦竞萌，何小明，林灵，
申请(专利权)人：上海华藤生物科技有限公司上海宝藤医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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