磷脂酶D-PKV-S109L及其应用制造技术

本发明专利技术公开了磷脂酶D

【技术实现步骤摘要】
磷脂酶D
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PKV
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S109L及其应用


[0001]本专利技术涉及磷脂酶D
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PKV
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S109L及其应用，属于酶的基因工程


技术介绍

[0002]磷脂（Phospholipid），也称磷脂类、磷脂质，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。磷脂是组成生物膜的主要成分，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，分别由甘油和鞘氨醇构成。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头基，另一端为疏水（亲油）的长烃基链。磷脂在人体的免疫反应中起重要作用，在制药、化妆品、食品等领域中也有广泛的应用。
[0003]甘油磷脂分子包括两个脂肪酸链，中间极性的甘油主链和极性亲水头基。不同种类的结构型功能磷脂大多是由极性头部的不同区分的，最常见的结构磷脂有磷脂酰丝氨酸（PS），磷脂酰甘油（PG），磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰肌醇（PI）等。使用专一性的磷脂酶D（Phospholipase D，PLD，E.C.3.1.4.4）制备结构型功能磷脂是目前常用的方法。磷脂酶D可催化磷脂水解为磷脂酸，还可催化磷脂酰胆碱（PC）转化为其他类型的结构磷脂。不同结构的磷脂酶D有不同的底物谱、催化效率、稳定性、产物抑制性等特性。现有技术中的磷脂酶D用于制备磷脂酰肌醇时，产率不甚理想，有必要对其进行改进。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术公开了磷脂酶D
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PKV
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S109L及其应用。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：磷脂酶D
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PKV
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S109L，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.3所示。
[0006]磷脂酶D
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PKV
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S109L的编码基因，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.4所示。
[0007]所述磷脂酶D
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PKV
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S109L在制备磷脂酰肌醇中的应用。具体应用时，以磷脂和肌醇为底物，在磷脂酶D
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PKV
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S109L的作用下，生成磷脂酰肌醇。
[0008]进一步地，具体应用方式为：向肌醇溶液中加入氯化钙，形成水相；向有机溶剂中加入磷脂，形成有机相；将水相和有机相混合，加入磷脂酶D
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PKV
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S109L，在35～70℃下反应8～16小时，制备得到磷脂酰肌醇。
[0009]进一步地，所述磷脂选自DHA
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磷脂酰胆碱（DHA
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Phosphatidylcholine，DHA
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PC）（受陆生动植物脂肪酸组成特点所限，大豆、蛋黄显然无法成为天然DHA磷脂的原料）。DHA
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磷脂酰胆碱来源于鱿鱼卵，鱿鱼卵中含有较高含量的多不饱和脂肪酸磷脂，且DHA含量较高。从鱿鱼卵中提取DHA
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磷脂酰胆碱常采用有机溶剂浸提法（现有技术中的常规技术手段）。
[0010]进一步地，所述肌醇溶液中，肌醇的浓度为1 M，溶剂为磷酸
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磷酸钠缓冲液（20 mM，pH 6.0）；氯化钙在水相中的浓度为50 mM。所述有机溶剂选自环戊基甲醚。所述磷脂在有机相中的浓度为10 mg/mL。所述肌醇溶液与有机溶剂的体积比为1:1。所述磷脂酶D
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PKV
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S109L的添加量为：每1 mmol肌醇添加7～10 mg磷脂酶D
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PKV
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S109L。反应条件为：在40℃下水浴反应12小时。
[0011]一种制备磷脂酰肌醇的方法：以磷脂和肌醇为底物，在磷脂酶D
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PKV
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S109L的作用下，生成磷脂酰肌醇。
[0012]进一步地，所述制备磷脂酰肌醇的方法具体为：向肌醇溶液中加入氯化钙，形成水相；向有机溶剂中加入磷脂，形成有机相；将水相和有机相混合，加入磷脂酶D
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PKV
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S109L，在35～70℃下反应8～16小时，制备得到磷脂酰肌醇。
[0013]进一步地，所述磷脂选自DHA
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磷脂酰胆碱。
[0014]进一步地，所述肌醇溶液中，肌醇的浓度为1M，溶剂为磷酸
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磷酸钠缓冲液（20mM，pH6.0），氯化钙在水相中的浓度为50mM。所述有机溶剂选自环戊基甲醚。所述磷脂在有机相中的浓度为10mg/mL。所述肌醇溶液与有机溶剂的体积比为1:1。所述磷脂酶D
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PKV
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S109L的添加量为：每1mmol肌醇添加7～10mg磷脂酶D
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PKV
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S109L。反应条件为：在40℃下水浴反应12小时。
[0015]本专利技术在深入了解蛋白质的三维结构和功能的基础上，结合生物信息学的知识，分析分子结构与功能之间的关系，从而修饰氨基酸位点，通过改变DNA序列中的碱基来实现某些氨基酸的替换，进而影响蛋白的三维结构和酶学性质，从而获得了底物特异性更强的磷脂酶D
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PKV
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S109L，可用于高效制备磷脂酰肌醇。本专利技术的制备磷脂酰肌醇的方法，底物转化率高，磷脂酰肌醇的产率可达57.04%，相比于磷脂酶D
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PKV，产率提升了22.64%。
[0016]本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
[0017]图1：考马斯亮蓝标准曲线示意图。
[0018]图2：氯化胆碱溶液标准曲线示意图图3：温度变化对相对酶活的影响示意图。
[0019]图4：pH变化对相对酶活的影响示意图。
[0020]图5：金属离子对相对酶活的影响示意图。
[0021]图6：磷脂酶D
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PKV与肌醇的分子对接示意图。
[0022]图7：磷脂酶D
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PKV
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S109L与肌醇的分子对接示意图。
[0023]图8：液相检测结果示意图，其中，位于下侧的图谱代表的是磷脂酶D
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PKV作用后的反应液，位于上侧的图谱代表的是磷脂酶D
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PKV
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S109L作用后的反应液。
实施方式
[0024]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0025]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
[0026]实施例1磷脂酶D...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D
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PKV
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S109L，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.权利要求1所述的磷脂酶D
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PKV
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S109L在制备磷脂酰肌醇中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：具体应用时，以磷脂和肌醇为底物，在磷脂酶D
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PKV
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S109L的作用下，生成磷脂酰肌醇。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：向肌醇溶液中加入氯化钙，形成水相；向有机溶剂中加入磷脂，形成有机相；将水相和有机相混合，加入磷脂酶D
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PKV
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S109L，在35～70℃下反应8～16小时，制备得到磷脂酰肌醇。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述磷脂选自DHA
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磷脂酰胆碱。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肌醇溶液中，肌醇的浓度为1 M，溶剂为磷酸
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磷酸钠缓冲液；氯化钙在水相中的浓度为50 mM；所述有机溶剂选自环戊基甲醚；所述磷脂在有机相中的浓度为10 mg/mL；所述肌醇溶液与有机溶剂的体积比为1:1；所述磷脂酶D
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PKV
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S109L的添加量为：每1 mmol肌醇添加7～10 mg磷脂酶D
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PKV
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S1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建安，贺晨曦，毛相朝，陈曦，刁汝静，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：