本发明专利技术提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒根据猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计多组套式PCR引物，并通过引物筛选以及反应体系优化，研发出一种检测灵敏性高、特异性好的套式PCR检测试剂盒。本发明专利技术提供的检测试剂盒只需要一台普通PCR仪，即可获得与实时荧光定量PCR相当的检测灵敏性，不仅可监测猪非典型性瘟病毒的微量潜伏感染，实现对猪非典型性瘟病毒的早期预警，同时检测成本低，对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。
Nested RT-PCR primers, kit and application for detection of swine atypical distemper virus
【技术实现步骤摘要】
检测猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及检测猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用。
技术介绍
非典型猪瘟(APP)是猪非典型性瘟病毒(Atypicalporcinepestivirusvirus，APPV)引起的仔猪先天性震颤(俗称“抖抖病”)，APPV临床上可以导致出生仔猪全身肌肉震颤、八字腿、严重可导致全身震颤，吮乳困难。猪非典型性瘟病毒(APPV)是黄病毒科瘟病毒属的单链正链RNA病毒。基因组约为12KB，包括5'和3'非编码区域和一个多蛋白阅读框(ORF)。APPV是黄病毒科和瘟病毒属的成员，其中还包括牛病毒性腹泻病毒1型和2型(bvdv-1和bvdv-2)、猪瘟病毒(CSFV)和边界病病毒(BDV)以及其他病毒。最初，Arruda等人报道了从仔猪样本(血清、大脑、小脑、脊髓、脑脊液和肺)中检测到APPV，并伴有临床CT。回顾性研究表明，APPV至少从2005年开始在匈牙利猪群中流行。同样，西班牙一项为期20年(1997-2016)的猪血清学回顾性研究发现，早在1997年，西班牙猪就存在APPV。自2016年以来，中国广东、广西、四川、云南和江西的大型养猪场也报告了在CT猪群中检测到APPV。常规的病毒检测技术如病理切片、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次性确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量小的特点，特别适用于病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪，即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此，有必要建立对APPV套式PCR检测技术，不仅可监测APPV的微量潜伏感染，实现对APPV的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒，该试剂盒检测成本低，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪非典型性瘟病毒的微量潜伏感染，从而尽早实施正确的治疗方案，挽回经济损失。为此，本专利技术第一方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，所述引物根据检测猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。本专利技术第二方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品中提取核酸模板；2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮PCR扩增产物。3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物，得第二轮扩增产物；4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μL，包括：10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示核苷酸序列各1.4μL，PrimeScript1StepEnzymeMix1μL，2×1StepBuffer(DyePlus)12.5μL，待测样品RNA3μL，RNaseFreedH2O5.7μL。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括：50℃，30min；95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μL，包括：第一轮PCR扩增产物2μL，10μM的SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示核苷酸序列各1.4μL，dNTPMixture2μL，10×PCRBuffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRaTaq0.5μL，RNaseFreedH2O15.2μL。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括：95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，35个循环；最后72℃终延伸10min。本专利技术第三方面提供用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒，包括如本专利技术第一方面所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒的第一轮反应试剂包括：PrimeScript1StepEnzymeMix，2×1StepBuffer(DyePlus)，RNaseFreedH2O。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒的第二轮反应试剂包括：dNTPMixture，10×PCRBuffer(Mg2++plus)，TaKaRaTaq，RNaseFreedH2O。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测试剂盒对猪非典型性瘟病毒的最低检出量可低至10copies/μL。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR试剂盒可特异性检测鉴定猪非典型性瘟病毒(APPV)，不能检测出塞尼卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)中的一种或多种。本专利技术第四方面提供如本专利技术第一方面所述的套式PCR引物、如本专利技术第二方面所述的套式PCR检测方法或如本专利技术第三方面所述的套式PCR检测试剂盒在猪非典型性瘟病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高病毒微量感染时对猪非典型性瘟病毒的检出率，而对设备和人员技能要求较低，因此，适用于对猪非典型性瘟病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警，利于在养殖企业中得到应用和推广。附图说明图1为本专利技术实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR引物筛选电泳图，其中，泳道M为DNAMarkerDL5000，泳道1～3分别代表第一组外引物APPV-1-F1/R1、第二组外引物APPV-2-F1/R1、第三组外引物APPV-1-F3/R3的扩增样品，泳道6～8分别代表第一组内引物APPV-1-F2/R2、第二组内引物APPV-2-F2/R2、第三组内引物APPV-3-F2/R2的扩增样品；图2为本专利技术实施例提供的猪非典型性瘟病毒的套式RT-PCR外引物引物浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。
【技术特征摘要】
1.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪非典型性瘟病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。2.用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品中提取核酸模板；2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮PCR扩增产物。3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物，得第二轮扩增产物；4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。3.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μL，包括：10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示核苷酸序列各1.4μL，PrimeScript1StepEnzymeMix1μL，2×1StepBuffer(DyePlus)12.5μL，待测样品RNA3μL，RNaseFreedH2O5.7μL。4.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括：50℃，30min；95℃预变性5min后进入循环；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。5.如权利要求2所述的用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪非典型性瘟病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μL，包括：第一轮PCR扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，韦柳明，苏丹萍，谢永生，李锦辉，梁伟放，司广斌，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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