四种猪腹泻病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT‑PCR检测引物及试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明专利技术所述四重RT‑PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV F和PoRV R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV‑F和PDCoV‑R。本发明专利技术所述引物特异性强，具有可重复性，灵敏度高，且临床可靠性高。

Quadruple RT-PCR Primers and Kits for Detection of Four Porcine Diarrhea Viruses

【技术实现步骤摘要】
四种猪腹泻病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒
本专利技术涉及分子检测
，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，各种年龄和品种的猪都易感，其中2周龄以下仔猪的致死率可达100％。猪流行性腹泻病的不断爆发给我国带来了巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritisofswine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触性传染病，各个年龄的猪都易感，对仔猪的影响最为严重，致死率达100％。该病在世界各养猪国家均有发生，给世界养猪业带来了极大的经济损失。轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridas)，轮状病毒属(Rotavirus)，是引起幼龄儿童和多种幼龄动物病毒性腹泻的重要病原之一，在我国，1979年庞其方等人首次从儿童腹泻粪便中检测到轮状病毒，倪亚伟首次报道了短型猪RV的分离，随后我国兽医研究人员先后在犊牛和羔羊等多种动物的粪便中检测并分离到了轮状病毒，猪轮状病毒(PoRV)常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和大肠杆菌(E.coli)等混合感染，从而加重病情，因此，轮状病毒会危害全世界的人类健康，同时也会给畜牧业生产造成巨大的危害。猪丁型冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)是一种最近几年新出现的能够引起猪的腹泻的肠道冠状病毒。猪丁型冠状病毒主要引起仔猪的粥样腹泻、呕吐和昏睡等临床症状，调查结果显示，对仔猪具有较高的致病性，自从新的冠状病毒被发现后，已经在几个国家中被证实存在。临床上上述四种猪腹泻病毒感染情况较多，且混合感染的情况普遍存在，传统单项RT-PCR技术虽然具有快捷、特异性高的特点，但是并不适用与临床大规模的病毒检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒。本专利技术所述引物特异性强，具有可重复性，灵敏度高，且临床可靠性高。本专利技术提供了一组四重RT-PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDVF和PEDVR；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEVF和TGEVR；猪A群轮状病毒检测引物PoRV-F和PoRV-R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoVF和PDCoVR；所述PEDVF的序列如SEQIDNO.1所示；所述PEDVR的序列如SEQIDNO.2所示；所述TGEVF的序列如SEQIDNO.3所示；所述TGEVR的序列如SEQIDNO.4所示；所述PDCoV-F的序列如SEQIDNO.5所示；所述PDCoV-R的序列如SEQIDNO.6所示；所述PoRVF的序列如SEQIDNO.7所示；所述PoRVR的序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、2×TaqPCRMasterMix和水。优选的是，每28.5μL检测体系中含有PEDVF和PEDVR各0.4μL，TGEVF和TGEVR各0.35μL，PDCoV-F和PDCoV-R各0.25μL，PoRVF和PoRVR各0.5μL，2×TaqPCRMasterMix15μL和水8.5μL。优选的是，所述试剂盒的反应程序为：95℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃，1min，40个循环；72℃10min；4℃1h。本专利技术提供了猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物。利用本专利技术所述引物能够实现猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测，能够为进一步研究上述四种猪腹泻病毒流行情况作技术上的有力支持，为兽医临床大规模的流行病学调查的技术手段。本方法所述引物特异性强，后续使用时无非特异性扩增，具有可重复性，在灵敏度上略低于单一RT-PCR技术，但应用于临床检测，吻合率与单一RT-PCR一致，具有临床可靠性。附图说明图1为本专利技术提供的PEDV最佳退火温度图；图2为本专利技术提供的TGEV最佳退火温度图；图3为本专利技术提供的PDCoV最佳退火温度；图4为本专利技术提供的PoRV最佳退火温度；图5为本专利技术提供的PDCoV双酶切；图6为本专利技术提供的PEDV\PoRV\TGEV双酶切；图7为本专利技术提供的PEDV\TGEV\PoRV\PDCoV重组质粒PCR鉴定；图8为本专利技术提供的PEDV单一PCR灵敏度实验；图9为本专利技术提供的TGEV单一PCR灵敏度实验；图10为本专利技术提供的PDCoV单一PCR灵敏度实验；图11为本专利技术提供的PoRV单一PCR灵敏度实验；图12为本专利技术提供的四重RT-PCR方法退火温度优化结果；图13为本专利技术提供的四重RT-PCR的引物浓度的优化结果；图14为本专利技术提供的四重RT-PCR方法灵敏度验证结果；图15为本专利技术提供的四重RT-PCR方法特异性验证结果；图16为本专利技术提供的四重RT-PCR方法稳定性验证结果；图17为本专利技术提供的四重RT-PCR方法临床应用结果。具体实施方式本专利技术提供了一组四重RT-PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDVF和PEDVR；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEVF和TGEVR；猪A群轮状病毒检测引物PoRVF和PoRVR；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoVF和PDCoVR；所述PEDVF的序列如SEQIDNO.1所示；所述PEDVR的序列如SEQIDNO.2所示；所述TGEVF的序列如SEQIDNO.3所示；所述TGEVR的序列如SEQIDNO.4所示；所述PDCoV-F的序列如SEQIDNO.5所示；所述PDCoV-R的序列如SEQIDNO.6所示；所述PoRVF的序列如SEQIDNO.7所示；所述PoRVR的序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术中，所述引物的具体序列如表1所示。表1引物序列表在本专利技术中，所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)的检测引物对应的产物长度703bp；所述猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检测引物对应的产物长度639bp；所述猪A群轮状病毒(PoRV)的检测引物对应的产物长度271bp；所述猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的检测引物对应的产物长度383bp。本专利技术所述引物的组合具有高特异性和稳定性，能够在同一PCR反应体系中对四种病毒的目的片段同时进行有效扩增，从而达到在同一个PCR反应体系中可以同时检出上述四种病毒的能力，使得检测过程更加简便、省时省力和经济实惠，且所述引物之间不发生非特异性结合，可以有效避免产生引物二聚体和发夹结构，确保PCR高效扩增，增强该检测技术的特异性和敏感性。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、2×TaqPCRMasterMix和水。在本专利技术中，所述水优选为双蒸水。在本专利技术中，所述2×TaqPCRMasterMix优选购自TIANGEN公司，2×TaqPCRMa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组四重RT‑PCR检测引物，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV F和PoRV R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV F和PDCoV R；所述PEDV F的序列如SEQ ID NO.1所示；所述PEDV R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述TGEV F的序列如SEQ ID NO.3所示；所述TGEV R的序列如SEQ ID NO.4所示；所述PDCoV‑F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述PDCoV‑R的序列如SEQ ID NO.6所示；所述PoRVF的序列如SEQ ID NO.7所示；所述PoRV R的序列如SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组四重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDVF和PEDVR；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEVF和TGEVR；猪A群轮状病毒检测引物PoRVF和PoRVR；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoVF和PDCoVR；所述PEDVF的序列如SEQIDNO.1所示；所述PEDVR的序列如SEQIDNO.2所示；所述TGEVF的序列如SEQIDNO.3所示；所述TGEVR的序列如SEQIDNO.4所示；所述PDCoV-F的序列如SEQIDNO.5所示；所述PDCoV-R的序列如SEQIDNO.6所示；所述PoRVF的序列如SEQIDNO.7所示；所述PoRVR的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙裴，李亮，周亭宇，秦娟，李杰，占松鹤，王军，高亚成，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34