桑黄液体深层发酵培养工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化；(2)制备桑黄种子悬液；(3)一级发酵培养：利用发酵培养基对桑黄种子悬液进行扩大培养，得一级液体菌种；(4)二级发酵培养：利用发酵培养基对一级液体菌种进行再次扩大培养，得二级液体菌种；(5)发酵罐培养：利用发酵培养基以及桦褐孔菌发酵液对二级液体菌种进行发酵培养；所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10‑15:1混合后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经处理后所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，所得的发酵液；本发明专利技术有效提高了桑黄液体发酵产物中一些活性物质的含量。

Submerged Fermentation and Culture of Phellinus igniarius

【技术实现步骤摘要】
桑黄液体深层发酵培养工艺
本专利技术涉及一种桑黄液体深层发酵培养工艺。
技术介绍
桑黄(Phellinusigniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄有效成分由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器中(发酵罐或大三角瓶)处于最适温度、最适酸碱度，最适碳、氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，在短时问内就可以获得大量菌丝体，具有生产时间短，效率高，成本低等优点。同时，还会在发酵液中产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、甙类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种生理活性物质。然而，传统液体发酵生产桑黄的方法，桑黄发酵菌丝体的得率不高，桑黄菌丝体易老化，另外，发酵液中甾醇、多糖以及酶类的含量还有待于提高。双孢蘑菇学名为Agaricusbisporus(Lange)Sing,中文别名为蘑菇、洋菇，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，约占世界食用菌总产量的25％左右。由于新鲜的双孢蘑菇储藏期较短，故其国际贸易形式主要以罐藏加工产品为主，而罐藏加工生产时必须及时对鲜菇进行预煮杀青，防止蘑菇开伞，而预煮后的熟菇重量比鲜菇下降35％～40％，损失的重量变成工业废水。在中国，每年用于罐藏加工的双孢蘑菇原料约占双孢蘑菇总产量的80％，也就是说每年约有30％的双孢蘑菇产量变成工业废水而流失，而它是高BOD和COD含量的生产废水，其中COD的含量为540.29g/L，比国家三级排放标准高出13.07倍，直接排放会造成环境污染，而废水处理会增加企业的生产成本。这些废水中含有大量的营养成分，充分利用好蘑菇产业废水，将其被废为宝，具有极其深远的实际意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够提高桑黄发酵菌丝体得率、提高发酵液中甾醇、多糖以及酶含量并能够充分利用双孢蘑菇加工废水的桑黄液体深层发酵培养工艺。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化；(2)制备桑黄种子悬液；(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：1.本专利技术利用双孢蘑菇罐藏加工废水作为桑黄液体深层发酵培养的培养基来源，将双孢蘑菇罐藏加工废水变废为宝，减轻环境污染、避免水体富营养化。2.发酵培养基中榆树皮提取液的加入能够延迟桑黄发酵菌丝体老化，大大提高桑黄发酵菌丝体的得率。3.本专利技术将双孢蘑菇罐藏加工废水进行处理后，作为桑黄液体深层发酵培养的培养基来源，能够为桑黄发酵培养提供碳源与氮源。另外，双孢蘑菇罐藏加工废水以及桦褐孔菌发酵液中富含一些多糖、氨基酸、蛋白质、甘露醇等，它们的加入，可以为桑黄发酵培养提供一些外源刺激物，有效提高了桑黄液体发酵产物中一些活性物质的含量，如多糖、漆酶、甾醇等。具体实施方式下面结合实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-30℃活化6-8d。(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-30℃的条件下振荡培养5-7d，得所述桑黄种子悬液。(3)一级发酵培养：将85-95ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。(4)二级发酵培养：将200-250mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L(优选为2.5L)的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％(优选为4％)的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃(优选为28℃)，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在5.8-6.0(优选为5.8)。其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0(优选为5.8)，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。所述桑黄(ACCC51638)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，所述桦褐孔菌(ATCC42011)购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。其中，所述溶液A的制备方法为：a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为20-25℃，离心时间为15-20min；c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到15％-20％，得溶液A；所述榆树皮提取液的制备方法为：1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-7min，其中，榆树皮与水的料液比为1:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化；(2)制备桑黄种子悬液；(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2‑3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％‑5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％‑15％，在通气量为1:0.5‑1.5vvm，温度为25‑30℃，罐压为0.02‑0.04MPa下发酵培养5‑7天，得桑黄液体发酵产物；其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10‑15:1混合后，调节pH值为5.8‑6.0，再经121‑122℃，湿热灭菌10‑20min后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化；(2)制备桑黄种子悬液；(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。2.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：所述溶液A的制备方法为：a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为20-25℃，离心时间为15-20min；c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到15％-20％，得溶液A。3.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：所述榆树皮提取液的制备方法为：1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-7min，其中，榆树皮与水的料液比为1:2-1:3g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为10:1-12:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.1％-0.3％的果胶酶、占榆树皮重量的0.3％-0.5％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.2％-0.4％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在45-55℃，搅拌反应2-3h，之后将温度升至90-100℃，加热20-30min，再降温至室温，过滤，收集滤液B；2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家福，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35