一种基于酶切的巢式PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种基于酶切的巢式PCR方法，属于基因工程技术领域，解决了大批量PCR扩增不稳定及DNA的非特异性问题。方法包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后片段进行第二轮PCR的扩增。本发明专利技术提供的基于酶切的巢式PCR方法，整个流程使用两对引物，得到的模板进行二轮扩增时特异性远高于常规的巢式PCR，且使用这个模板进行大批量的PCR扩增时十分稳定，也不会产生非特异性扩增。

A Nested PCR Method Based on Enzyme Digestion

【技术实现步骤摘要】
一种基于酶切的巢式PCR方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种基于酶切的巢式PCR方法。
技术介绍
如何获得单一的DNA条带是制备DNA分子量标准的基础要素。DNA片段的获得无非来自三个途径。第一种DNA片段获得方式是质粒酶切。通过在载体中加入特定大小和比例的某些片段，并在片段中加入酶切位点，这样对提取的质粒进行酶切，即可得到设定大小和比例的片段。通常通过这种方式得到的条带之间浓度比例非常准确。这个方法能够适应较大片段的获得，但较难得到很多的小片段。第二种DNA片段获得方式是使用两条反向互补的引物退火。这个方式适用于较小的条带获得，例如小于100bp的条带都可以使用两条引物退火的方式获得。退火的引物条带是否单一取决于引物的质量和退火的效率。第三种DNA片段获得方式是PCR。虽然PCR能够扩增数十K的片段。但由于PCR的特性以及DNA分子量标准的要求，通常不会扩增很大的片段。更关键的问题是，PCR首先需要引物和模板的结合，难以避免的会产生较多的非特异性结合，这样就导致了非特异的扩增。即使小样实验时能够获得很单一的条带，而DNA分子量标准的产品对每个条带都需要非常多的量，放大PCR的规模时出现一些未知的小波动也会导致非特异的扩增产生。这样，PCR就显得难以控制且工作量极大。因此，一般的制备一个DNA分子量标准很难使用一种方法获得所有的片段，需要多种方法同时使用以适应不同大小的需要。巢式PCR是一种变异的PCR反应，整个流程使用两对引物。第一轮引物扩增的DNA片段较长，第二轮引物在第一轮引物内侧，扩增片段长度较短。这样的好处是，当第一轮PCR扩增产物中含有非特异扩增产物时，第二轮扩增引物不大可能在第一轮的非特异产物上结合，而正常模板可以结合，这样就可以极大提高PCR的特异性。但实际上，巢式PCR虽然提高了特异性，但仍然避免不了非特异的扩增。即使将第一轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，此问题一样得不到完美解决。在第二轮扩增时模板纯度不足是导致二轮扩增时非特异的一个重要因素，即使一轮产物已进行琼脂糖凝胶电泳纯化，也不能彻底的分离产生干扰的非特异片段。特别是制作DNAMarker时需要大量扩增高浓度的片段，巢式PCR一轮产物作为二轮模板扩增的模板无法达到使用要求。
技术实现思路
本专利技术针对PCR方法获得DNA片段时非特异扩增的问题，特别是针对大批量PCR扩增时不稳定的问题，提供一种基于酶切的巢式PCR方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于酶切的巢式PCR方法，包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后的片段进行第二轮PCR的扩增。上述基于酶切的巢式PCR方法，PCR扩增反应由预变性和30次扩增温度循环组成，循环条件为98℃预变性2min，98℃变性20s，58℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，循环结束后72℃补齐延伸1min后反应结束。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR方法，第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆，得到的模板特异性高，使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化，进一步提高了扩增片段的特异性和纯度，针对切下并纯化后的片段进行二轮扩增，特异性远高于常规的巢式PCR，且使用这个模板进行大批量的PCR扩增时十分稳定，也不会产生非特异性扩增。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1左为相同引物下100bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图2左为相同引物下150bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图3左为相同引物下200bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图4左为相同引物下250bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图5左为相同引物下300bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图6左为相同引物下400bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图7左为相同引物下500bpDNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本专利技术提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；图8为本专利技术提供的50bpladder的凝胶电泳图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步的详细介绍。本专利技术提供了一种基于酶切的巢式PCR方法，包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增。具体地，分别以100-500bp长度的lambdaDNA(从TaKaRa生物公司购买)为模板扩增一系列片段，模板加入量为1微升，聚合酶采用北京擎科新业生物公司的金牌试剂，加入量为45微升，所用第一轮扩增引物序列分别如表1，每对上、下游引物各2微升。PCR扩增反应由预变性和30次扩增温度循环组成，循环条件为98℃预变性2min，98℃变性20s，58℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，循环结束后72℃补齐延伸1min后反应结束。表1第一轮PCR引物序列名称序列号序列酶切位点100bp片段上游引物SEQID1AAGCTTCGTCAGAGAATTCTGGCGAATCCTCTGACCAHindIII100bp片段下游引物SEQID2AAGCTTGATATCGTTAGCCCACCCAGCAAAATTCGGHindIII150bp片段上游引物SEQID3AAGCTTCAGGGCGATCCGGCGTCGGTATCGTTCCGGATTHindIII150bp片段下游引物SEQID4AAGCTTACCTGTCTGATATCCGCAATCTGCTTTTCCGAGHindIII200bp片段上游引物SEQID5AAGCTTTGAAGCCTTCGATCCGGTTGAGGTGGATATGGGHindIII200bp片段下游引物SEQID6AAGCTTGTATCCAGCTTCTCCTTGACGGCTTTGAAGGAAHindIII250bp片段上游引物SEQID7AAGCTTGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGHindIII250bp片段下游引物SEQID8AAGCTTCTGCAGCGTGTCGAGCATCTTCATCTGCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后片段进行第二轮PCR的扩增。

【技术特征摘要】
1.一种基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后片段进行第二轮PCR的扩增。2.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID1和SEQID2所示，第二轮PCR引物如SEQID15和SEQID16所示。3.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID3和SEQID4所示，第二轮PCR引物如SEQID17和SEQID18所示。4.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文刚，王珍珍，
申请(专利权)人：湖北擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42