用于扩增核酸的方法和用于实施其的试剂盒技术

公开了一种扩增核酸的方法，其中基本上利用如下事实：在靶序列特异性激活物寡核苷酸的存在下可倍增/扩增预定义的核酸链(靶序列)。靶序列特异性激活物寡核苷酸通过链置换导致再生的互补引物延伸产物的分离，使得新的引物寡核苷酸可附接至相应的模板链。由此形成的引物寡核苷酸和模板链的复合物可引发新的引物延伸反应。由此形成的引物延伸产物又起模板的作用，从而产生指数扩增反应。这里，激活物寡核苷酸本身不起模板的作用，并且优选对引物延伸反应呈惰性。激活物寡核苷酸在反应中起辅助因子的作用，其再生反应所需模板的相关链区段的单链状态。通过使用包含至少一种引物寡核苷酸、至少一种聚合酶、一组聚合酶底物(例如dNTP)和至少一种特异性激活物寡核苷酸的一组组分，待扩增的核酸可被线性地扩增。通过使用此类组和第二引物寡核苷酸，可呈指数地扩增待扩增的核酸，其中得到的特异性引物延伸产物作为模板用于进一步的引物延伸反应。

Methods for amplifying nucleic acids and kits for their implementation

A method for amplifying nucleic acids is disclosed, which basically utilizes the fact that predefined nucleic acid chains (target sequences) can be multiplied/amplified in the presence of target sequence-specific activator oligonucleotides. Target sequence specific activator oligonucleotides lead to the separation of renewable complementary primer extension products through chain substitution, so that new primer oligonucleotides can be attached to the corresponding template chain. The resulting complex of primer oligonucleotides and template chains can trigger new primer extension reactions. The primer extension products thus formed act as templates, thus producing exponential amplification reaction. Here, the activator oligonucleotide itself does not act as a template, and the primer extension reaction is preferred to be inert. Activator oligonucleotides play an auxiliary role in the reaction, and their regeneration requires the single-chain state of the relevant chain segments of the template. The nucleic acid to be amplified can be linearly amplified by using a set of components containing at least one primer oligonucleotide, at least one polymerase, a set of polymerase substrates (such as dNTP) and at least one specific activator oligonucleotide. By using these groups and second primer oligonucleotides, the nucleic acids to be amplified can be amplified exponentially, and the specific primer extension products obtained can be used as templates for further primer extension reactions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于扩增核酸的方法和用于实施其的试剂盒如今，核酸链的合成在生物技术中起着核心作用。像PCR这样的方法显着地发展了应用的研究领域和工业领域，例如医学中的诊断和食品工业。PCR与其他技术例如测序、实时检测、微阵列技术、微流控管理等的结合促进了基础技术的技术发展，并且能够部分地克服PCR基础技术的一些障碍。此外，已经开发了进一步的扩增方法例如等温扩增技术(LAMP、HDA、RPA、TMA、SDA等)。它们特别适用于POCT领域。尽管在该领域取得了巨大进步，但PCR起着核心作用并因此确定应用的各个技术障碍。常见的扩增方法例如PCR的性质之一是在核酸的扩增操作期间，两个引物之间的扩增序列部分不受控制。基本上，引物结合是PCR扩增反应优化的焦点。在PCR扩增开始及其过程中，连续地或多或少地发生特异性引物结合以及主产物和副产物合成的引发。例如，副产物可作为合成循环中非特异性引物延伸事件的结果而产生。在任选地发生反向合成反应的情况下，读取非特异性延伸的引物作为模板，其通常导致形成完整的引物结合位点。因此，不正确的序列信息从一个合成循环转移到下一个合成循环，这在合成循环的总和中不仅导致初始生成，而且最重要的是导致副产物的指数增加。这些副反应可分别导致干扰主反应(靶序列扩增)的片段的初始产生和指数增加，并分别导致后续分析步骤中的干扰。这些副产物通常包括引物序列和使得它们的扩增可与主反应并行的相应的引物序列(图1)。然而，这种副产物不是靶序列，而是包括另一种核酸序列。为了优化主产物的合成并使副产物的产生最小化，通常优化引物序列并选择支持引物键特异性的这种反应条件。如果仍然发生副产物的引发，则这些通常可与主产物并行复制，因为所有新形成的链在扩增方法期间变性而与其组成无关。在该步骤中，引物结合位点被再生，这代表了新合成轮次的先决条件。在诸如PCR或HDA或SDA的方法中，使用不引起序列依赖性链分离的方法(在PCR中使用升温，在HDA中使用解旋酶和ATP，在SDA中使用能够链置换的聚合酶)。因此，在主产物和副产物中均可再生用于新键和随后的合成反应的引物结合位点。在单次引发后，如果使用的引物找到相应的引物结合位点，则可并行复制主产物和副产物。对这种副反应特别敏感的是扩增方法，其必须在于某些情况下难以控制的反应条件下进行(例如，即时检验)或在具有有利于副反应的因子的强烈存在的反应条件下进行(例如在存在大量野生型序列的情况下扩增具有轻微序列分歧例如突变或SNV的序列片段，这种分析例如在法医学、产前诊断或例如在ctDNA检测中作为液体活检调查的一部分而可为重要的)。作为优先事项，通过优化与靶序列的引物结合来实现PCR扩增的特异性。这里，例如可使用能够部分结合引物的另外的寡核苷酸，其因此竞争性地参与引物与其他核酸链的结合。这种探针通常与引物的序列部分结合，并且在引物上留下未被占据的单链序列部分，使得具有该部分的引物可与靶核酸结合并引发合成反应。此处，引物结合的特异性将通过如下的事实来改善：引物模板错配可被这种寡核苷酸竞争性地置换。结果，通常可提高PCR反应起始的特异性。这种寡核苷酸的作用限于与引物序列的相互作用。这些另外的寡核苷酸不与两个引物之间的部分(段，Abschnitt)中待扩增的核酸链相互作用。然而，由于引物摩尔过量，引物与模板的非特异性相互作用可在扩增过程中发生。如果发生引物延伸的这种非特异性事件(指数副反应的引发)，则形成全功能性引物结合位点作为结果或作为副产物的互补链的反向合成的一部分。副产物中此类完整的引物结合位点的存在导致这种另外的寡核苷酸对引物结合的竞争效应的丧失。因此，通过这种寡核苷酸控制引物与模板结合的特异性使得仅引发副反应的可能性较小，但在产生副产物后几乎不会影响其指数扩增。此外，作为检测方法的一部分，经标记的寡核苷酸探针通常用于改善对某些序列的特定证据进行分析的特异性。这些探针基本上不影响指数扩增。通常，探针需要足够高浓度的核酸链，因此，如果存在足够的产物，则它们对扩增的末端阶段产生影响(例如TaqMan探针或LightCycler探针)。通常，利用减少与靶序列不同的副产物的产生和共扩增来提高扩增方法的合成特异性可例如有助于改善诊断方法。本专利技术的一个目的是提供能够酶促合成和扩增核酸链的方法和组分。旨在提供用于核酸链合成以及核酸链扩增的新酶促方法和组分。本专利技术的另一个目的是提供在指数扩增中具有提高的靶核酸链合成特异性的方法。本专利技术的另一个目的是提供用于实现具有提高的合成特异性的指数扩增方法的手段。本专利技术的另一个目的是提供验证引物之间的合成的序列部分并且能够取决于它们与序列靶标的匹配度而分别影响扩增反应的功效或序列的扩增反应的持续时间的手段和方法。本专利技术的另一个目的是提供能够实时验证合成的序列并在进一步的扩增循环中对合成的序列的适用性进行控制(实时控制/在线质量控制)的手段和方法。本专利技术的另一个目的是提供如下的手段和方法：其提供具有验证核酸链含量的反馈功能的核酸链的指数扩增方法。这里，验证的反馈功能与指数扩增并行。这里，各个扩增元件形成控制系统。利用根据本专利技术的方法，分别合成和扩增确定的序列组成的核酸链。通过提供扩增方法和用于执行该方法的相应的手段来解决本专利技术的问题。优选地，扩增为指数扩增，其中两种引物的再合成产物(引物延伸产物)作为模板用于进一步的合成步骤。这里，引物序列至少部分地被复制，从而产生互补的引物结合位点，其在合成后立即作为双链的序列区段存在。在扩增方法中，再生的序列部分的两条链的合成步骤和双链打开步骤以相互交替的方式进行。合成后足够的双链分离代表了进一步合成的重要先决条件。总之，这种合成和双链分离步骤的交替可导致指数扩增。在根据本专利技术的扩增方法中，扩增(包括靶序列的核酸链的扩增)的主产物的双链打开尤其借助于被称为激活物寡核苷酸的寡核苷酸进行。激活物寡核苷酸优选地包括对应于靶序列的序列区段。详细地，根据本专利技术，通过使用具有预定义序列的激活物寡核苷酸实现链分离，所述预定序列优选地通过序列依赖性的核酸介导的链置换来分离由两种特定的引物延伸产物组成的再生的双链。所得的引物延伸产物的单链区段包括靶序列以及相应的引物结合位点(其可用作另外的引物寡核苷酸的结合位点)，从而实现待扩增的核酸链的指数扩增。基本上，引物延伸反应和链置换反应优选地同时进行。扩增优选地在不允许两种特定合成的引物延伸产物的自发分离的反应条件下进行。包括靶序列的核酸链的特异性指数扩增包括重复合成步骤和双链打开步骤(引物结合位点的激活步骤)作为核酸链倍增的强制性先决条件。合成的双链的打开作为反应步骤实施，其受激活物寡核苷酸序列特异性地影响。所述打开可完全地进行直至两种互补的引物延伸产物的解离，或者也可部分地进行。根据本专利技术，激活物寡核苷酸包括可与靶序列相互作用的序列部分和分别引起、允许或支持所述相互作用的另外的序列部分。在与激活物寡核苷酸的相互作用的过程中，合成的引物延伸产物的双链段通过序列特异性链置换转化成单链形式。该过程是序列依赖性的：只有当合成的双链的序列具有一定量的与激活物寡核苷酸的相应序列的互补性时，才出现足够的双链打开，使得对于继续合成必需的序列部分，例如引物结合位点被转化成单链形式，其对应于“活性状态”。因此，激活物寡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于扩增核酸的方法，包括以下步骤：a)将第一引物寡核苷酸与待扩增的核酸链的3'区段杂交，其中待扩增的核酸链包含靶序列，其中第一引物寡核苷酸包含：·第一引物寡核苷酸的3'区段中的第一引物区域，其可序列特异性结合待扩增的核酸链的链，·第二区域，其直接或经由接头连接到第一引物寡核苷酸的第一引物区域的5'末端并且包含适合于结合激活物寡核苷酸并支持通过激活物寡核苷酸的链置换(步骤c)的多核苷酸尾，其中多核苷酸尾在选定的反应条件下基本上保持未通过聚合酶复制，b)通过聚合酶延伸第一引物寡核苷酸以形成第一引物延伸产物，其包含与待扩增的核酸链(a)的靶序列互补的序列，c)将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，其中所述激活物寡核苷酸包含：·第一单链区域，其可与第一引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，·第二单链区域，其基本上是互补的并且可与第一引物寡核苷酸的第一区域结合，·第三单链区域，其与第一引物延伸产物的已通过聚合酶合成的延伸产物的至少一区段基本上互补，其中激活物寡核苷酸不作为用于第一引物寡核苷酸的引物延伸的模板，d)通过置换与所述第一引物区域互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第一引物区域结合，e)通过置换与所述延伸产物互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的延伸产物的互补区段结合，其中第一引物延伸产物的3'区段变成单链，f)将第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物杂交，其中第二寡核苷酸引物的3'区段包含可与第一引物延伸产物杂交的序列；和g)用聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成第二引物延伸产物，其中延伸发生直至并包括第一引物寡核苷酸的第一引物区域，并且所述第一引物区域通过聚合酶复制，其中第二区域的多核苷酸尾保持未被复制，h)重复步骤a)‑g)直至达到所期望的扩增程度。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.25 EP 16185624.01.用于扩增核酸的方法，包括以下步骤：a)将第一引物寡核苷酸与待扩增的核酸链的3'区段杂交，其中待扩增的核酸链包含靶序列，其中第一引物寡核苷酸包含：·第一引物寡核苷酸的3'区段中的第一引物区域，其可序列特异性结合待扩增的核酸链的链，·第二区域，其直接或经由接头连接到第一引物寡核苷酸的第一引物区域的5'末端并且包含适合于结合激活物寡核苷酸并支持通过激活物寡核苷酸的链置换(步骤c)的多核苷酸尾，其中多核苷酸尾在选定的反应条件下基本上保持未通过聚合酶复制，b)通过聚合酶延伸第一引物寡核苷酸以形成第一引物延伸产物，其包含与待扩增的核酸链(a)的靶序列互补的序列，c)将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，其中所述激活物寡核苷酸包含：·第一单链区域，其可与第一引物寡核苷酸的第二区域的多核苷酸尾结合，·第二单链区域，其基本上是互补的并且可与第一引物寡核苷酸的第一区域结合，·第三单链区域，其与第一引物延伸产物的已通过聚合酶合成的延伸产物的至少一区段基本上互补，其中激活物寡核苷酸不作为用于第一引物寡核苷酸的引物延伸的模板，d)通过置换与所述第一引物区域互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的第一引物区域结合，e)通过置换与所述延伸产物互补的待扩增的核酸链的链，将激活物寡核苷酸与第一延伸引物寡核苷酸的延伸产物的互补区段结合，其中第一引物延伸产物的3'区段变成单链，f)将第二寡核苷酸引物与第一引物延伸产物杂交，其中第二寡核苷酸引物的3'区段包含可与第一引物延伸产物杂交的序列；和g)用聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成第二引物延伸产物，其中延伸发生直至并包括第一引物寡核苷酸的第一引物区域，并且所述第一引物区域通过聚合酶复制，其中第二区域的多核苷酸尾保持未被复制，h)重复步骤a)-g)直至达到所期望的扩增程度。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：D谢尔卡索夫，N巴斯勒，C贝克尔，HJ赫斯，A米勒赫尔曼，
申请(专利权)人：AGCT有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE