从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒，所述方法利用磁珠偶联探针来富集粪便样本中的相关基因组DNA，并进一步利用巢式PCR来进行胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因片段的扩增，此基因片段可用于下游单碱基突变的荧光定量PCR检测或者膜芯片检测。本方法及试剂盒能够从组成成分复杂、PCR抑制剂较多的粪便中富集目标片段，为下一步的检测提供了纯度和质量较高的模板DNA，实现了对胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因检测的无创、无痛化，有利于彻底改变Hp感染的诊治模式，具有很好的创新价值和科研意义。

Methods and kits for enriching genes related to the treatment of Helicobacter pylori from feces

The present invention relates to a method and kit for enriching genes related to the treatment of gastric Helicobacter pylori from feces. The method uses magnetic bead coupling probes to enrich relevant genomic DNA in fecal samples, and further uses nested PCR to amplify gene fragments related to individual drug eradication therapy of gastric Helicobacter pylori. The gene fragments can be used for fluorescence of downstream single base mutations. Quantitative PCR or membrane chip detection. This method and kit can enrich target fragments from feces with complex components and more inhibitors of PCR. It provides template DNA with high purity and quality for further detection, realizes non-invasive and painless detection of genes related to individual drug eradication therapy of Helicobacter pylori in stomach, and is conducive to thoroughly changing the diagnosis and treatment mode of Hp infection. It has good innovative value and science. Research significance.

【技术实现步骤摘要】
从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及无创富集及检测胃幽门螺杆菌
，具体涉及从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒。
技术介绍
幽门螺旋杆菌，英文名Helicobacterpylori，简称Hp。是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内。它会引起胃黏膜轻微的慢性发炎，甚或导致胃及十二指肠溃疡与胃癌。世界卫生组织(WHO)癌症协会规定幽门螺杆菌是细菌中唯一的I类致癌因子。幽门螺旋杆菌国际共识会议(MaastrichtIV)、WHO-IARC《根除Hp可作为预防胃癌策略》、《Hp胃炎京都共识》均认为Hp感染者应给予根除治疗。《2016年欧美儿童/青少年(＜18岁)Hp感染处理相关指南》强烈推荐基于Hp药物敏感试验结果制定根除方案。我国是幽门螺旋杆菌感染重灾区，感染率高达到40％-60％，由于生活环境和习惯，使得许多人在儿童时期就感染了幽门螺旋杆菌。在中国，共餐制使得儿童更容易受到Hp的感染，大部分成人Hp感染在儿童期获得，大多发生在儿童早期，感染后一般难以自发清除而导致终生感染。目前我国面临的核心问题是Hp菌株对抗生素耐药性显著升高，各种经验性根除方案的疗效明显下降。实现Hp感染个体化根除治疗临床广泛应用的目标需要克服两个关键的瓶颈问题：1)建立简便、舒适、无侵入性、价廉的待检标本取材方式；2)建立简便、快速、准确、价廉的相关基因检测技术，而前者是解决儿童Hp感染个体化根除治疗以及临床广泛应用的前提和基础，并且其也是后者实现的基础。因此，提高胃幽门罗杆菌的根除率，降低其感染率的首要就是要推广个体化治疗，而推广个体化治疗的前提就是要实现其简便、舒适以及无侵入性。已有相关研究结果显示，对胃黏膜和胃液标本进行Hp菌株克拉霉素或左氧氟沙星耐药基因突变以及人宿主CYP2C19基因多态性检测是切实可行的，但需借助胃镜或胃管置入获得检测标本，患者痛苦性大、花费较贵、设备和技术要求较高，难以临床广泛应用，尤其是在儿童和老年患者中。而粪便标本取材简便、舒适性好、价格低廉、无侵入性，适用于各种人群，适合于各级医疗卫生条件的地区和单位，是实现Hp感染个体化根除治疗在临床上广泛开展的重要途径。但是粪便的组成成分复杂，有：胃肠黏膜细胞、Hp以及各种胃肠道菌群、食物残渣、蛋白、脂肪、色素等，这些使得粪便基因组DNA的提取难度很大，提取DNA质量不高甚至粪便中的一些成分会对后期PCR反应有抑制作用。商业化的粪便基因组DNA提取试剂盒良莠不齐，即使能够提取出基因组DNA的，幽门螺杆菌的DNA丰度也非常低。这些情况都阻碍对幽门螺杆菌个体化治疗的推广和应用，特别是在儿童和老人人群中，幽门螺杆菌个体化治疗就更难以实现。本专利技术针对粪便样本，利用磁珠技术偶联探针，有目的的钓取幽门螺杆菌基因片段并且利用巢式PCR技术对目的基因片段进行进一步富集，为后续胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的检测提供了高纯度、高质量的DNA模板片段，可以实现儿童、老年人幽门螺杆菌个体化治疗，有利于幽门螺杆菌个体化治疗的推广和根除。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒，所述试剂盒包括胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因捕获探针，通过捕获探针可特异性的从粪便中获得目标基因组片段，再结合巢式PCR扩增目标基因片段，获得的产物可用于下一步检测胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因型。进一步地，所述试剂盒中包括磁珠、捕获探针、巢式PCR引物对、PCR反应液。进一步地，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23SrRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针，以及靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(RnaseP)基因组DNA的捕获探针。其中，所述RnaseP探针为体系内参，其可在后续检测过程中监测DNA提取是否成功。进一步地，所述捕获探针的5′端标记生物素；所述磁珠为链霉亲和素磁珠。进一步地，所述巢式PCR引物对用于扩增幽门螺杆菌23SrRNA、gyrA、ureH基因片段和人CYP2C19、RnaseP基因片段。进一步优选地，所述捕获探针如下：人CYP2C19基因组DNA序列设计的捕获探针A与B：探针A序列为：探针B序列为：Hp菌的23SrRNA基因组DNA序列设计的捕获探针C与D：探针C序列为：探针D序列为：Hp菌的gyrA基因组DNA序列设计的捕获探针E与F：探针E序列为：探针F序列为：Hp菌的ureH基因组DNA序列设计的捕获探针G与H：探针G序列为：探针H序列为：人RnaseP基因组DNA序列设计的探针I与J：探针I序列为：探针J序列为：优选地，所述巢式PCR引物对如下：进一步地，本专利技术目的是提供一种基因组DNA富集方法，其特征在于，所述方法适用于从粪便样本中富集胃幽门螺杆菌基因组DNA，所述方法步骤如下：(1)利用磁珠技术偶联捕获探针从粪便样品中提取富集基因组DNA；(2)巢式PCR扩增富集目标基因；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23SrRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针。进一步优选地，所述捕获探针还包括靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(RnaseP)基因组DNA的捕获探针。进一步地，本专利技术目的是提供一组捕获探针，所述捕获探针能够与磁珠技术配合使用从而当以粪便为样本时可特异性提取、富集胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因片段。进一步地，本专利技术目的是提供一组巢式PCR引物，所述引物能够特异性扩增、富集胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因的基因片段。本领域公知，可依据多种现有技术对基因片段进行检测，包括但不限于：测序、SNP单突变检测、基因芯片、熔解曲线分析等。有益效果本专利技术试剂盒能够从组成成分复杂、PCR抑制剂较多的粪便中获得目标片段；并且能够富集目标片段，为下一步的单碱基突变的检测提供纯度和质量较高的模板DNA，解决了在胃幽门螺杆菌个体化药物根除相关基因的检测中必须以胃粘膜为样本，从粪便中很难获得相关的基因片段的问题，从根本上实现了对胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因检测的无创、无痛化，有利于彻底改变Hp感染的诊治模式，具有很好的创新价值和科研意义。附图说明图1粪便标本DNA提取后PCR产物电泳检测和芯片检测结果(A)电泳检测23SrRNA、gyrA和CYP2C19基因PCR扩增产物，E1为国外某商品化粪便DNA提取试剂盒PCR扩增产物，E2为国内某商品化粪便DNA提取试剂盒PCR扩增产物，E3为本方法提取的PCR扩增产物；(B)基因芯片检测CYP2C19基因型为CYP2C19＊2/＊2(慢代谢)；(C)基因芯片检测患者粪便中Hp23rRNA基因型为2143A→G；(D)基因芯片检测患者粪便中HpgyrA基因型272A→G。具体实施方式在下文中更详细地描述了本专利技术以有助于对本专利技术的理解。应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本专利技术上下文中的含义一致的含义：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括磁珠、捕获探针、巢式PCR引物对、PCR反应液；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23S rRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针，以及靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(Rnase P)基因组DNA的捕获探针。

【技术特征摘要】
1.一种从粪便标本中获得胃幽门螺杆菌个体化药物根除治疗相关基因信息的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括磁珠、捕获探针、巢式PCR引物对、PCR反应液；其中，所述捕获探针为靶向幽门螺杆菌23SrRNA基因组DNA、gyrA基因组DNA和ureH基因组DNA的捕获探针，以及靶向人CYP2C19基因组DNA、人核糖核酸酶P(RnaseP)基因组DNA的捕获探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的5′端标记有生物素；所述磁珠为链霉亲和素磁珠。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述巢式PCR引物对用于扩增幽门螺杆菌23SrRNA、gyrA、ureH基因片段和人CYP2C19、RnaseP基因片段。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针如下：人CYP2C19基因组DNA序列设计的捕获探针A与B：探针A序列为：5′BIOTIN-TCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCC3′；探针B序列为：5′BIOTIN-GAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC3′；Hp菌的23SrRNA基因组DNA序列设计的捕获探针C与D：探针C序列为：5′BIOTIN-CGCGATAAGGTGTGCCGCAGCAATG3′；探针D序列为：5′BIOTIN-GATTTCCAACCGCAATGAGCCAACC3′；Hp菌的gyrA基因组DNA序列设计的捕获探针E与F：探针E序列为：5′BIOTIN-CCGTGCATAGGCGTATTTTGTATGC3′；探针F序列为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志强，周丽雅，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：北京,11