一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法技术

本发明专利技术提供了一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，它将核酸扩增反应液置于反应管中，在核酸扩增反应液上覆盖油相层，进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应结束后，在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下，将合适体积的CRISPR体系加入反应管，通过离心作用，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察反应管，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。本发明专利技术利用CRISPR体系结合核酸扩增技术，实现对目标物进行快速特异性的可视化检测，并且在检测过程中可以避免由于添加CRISPR体系带来的气溶胶污染问题。

A Rapid Visualization and Aerosol Contamination Prevention Method for Nucleic Acid Field Inspection

The present invention provides a fast visualization and aerosol-contaminated nucleic acid field inspection method. It places the nucleic acid amplification reaction liquid in the reaction tube, covers the oil phase layer on the nucleic acid amplification reaction liquid, and carries out nucleic acid amplification reaction. After the nucleic acid amplification reaction is completed, when the oil phase layer is covered with the nucleic acid amplification liquid, a suitable volume CRISPR system is added to the reverse reaction. Should tube, through centrifugation, make nucleic acid amplifier and CRISPR system mix and react. After reaction to a certain extent, under the irradiation of ultraviolet lamp, use naked eye observation or camera equipment to observe the reaction tube. If there is fluorescence, the test results are positive, otherwise it is negative. The invention utilizes CRISPR system combined with nucleic acid amplification technology to realize rapid and specific visual detection of target, and avoids aerosol pollution caused by adding CRISPR system in the detection process.

【技术实现步骤摘要】
一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法
本专利技术属于核酸扩增和核酸检测领域，其具体内容涉及到一种简单快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法。
技术介绍
在核酸检测过程中，为提高检测的灵敏度，需要首先对核酸目标物进行大量扩增，以便于后续检测。聚合酶链式反应(PCR)，作为核酸检测的黄金标准，已广泛应用于医学诊断、农产品质量检测、食品安全检查等众多领域。传统的PCR扩增是建立在三个反应温度以及一定循环数上的重复反应。一般而言，PCR扩增每个循环需要提供三个反应温度以及相应适宜的时间。三个反应温度对应三个阶段，分别为变性阶段(95℃)、退火(55℃～65℃)、延伸(72℃)。现有通过PCR扩增的核酸检测总耗时较长。根据模板的不同和扩增酶的不同，可选择性的调整三个阶段的持续时间，以及在起始和结尾加入预变性和延伸阶段。对于PCR反应而言，最关键的是满足每个阶段的温度要求，因此这就需要对温控十分精细的热块，并且对于它还要兼有快速升降温的功能，以减少反应的整体时间。除了PCR反应之外，一些等温扩增技术也被日益开发出来，诸如环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶扩增技术(RPA)等。这些恒温扩增技术其最大的技术特点就是在反应过程中是以恒定的温度进行，无需进行温度的循环控制，相比于PCR反应来说，可以简化反应仪器，并且缩短反应的整体时间。另外，对于扩增产物的检测，传统的方法为利用凝胶电泳，该检测方法耗费较多时间和人力，且要对扩增产物进行开盖，容易形成气溶胶污染，且电泳所用的化学品对人体危害较大。而现在使用较多的则是实时荧光的检测方法，该方法一般采用DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO9、SYBRGreenI、GelRed等，利用实时荧光PCR仪对反应的整个过程中Ct值的大小来进行记录进而间接表征核酸扩增情况。为了提高检测的特异性，一些分子探针被开发出来，如水解探针(Taqman探针)、杂交探针(分子信标)、复合探针等。它们在核酸扩增的过程中利用碱基互补配对的原则与模板进行互补配对，从而实现对核酸扩增进行特异性实时检测。但这些利用探针的检测方法，通常需要较复杂的实时荧光PCR仪来读取数据，因此成本较高，耗时较长，在推广上受到了限制。目前，CRISPR体系被逐渐开发应用。这个方法常用于基因编辑领域。随着typeV酶的开发，开始有研究人员将该体系应用到核酸检测上。其主要原理是由于typeV酶可在体系中guideRNA的辅助下，特异性的识别靶标DNA，同时，在识别靶标物的过程中会激活自身的基因编辑功能，可以对体系中的任意单链DNA进行切割。目前已有的利用CRISPR体系来进行核酸检测的方法普遍需要复杂、大型的仪器进行荧光读取和结果判定。有些则利用该体系集成一些装置如试纸条等来进行检测，但对于实验的环境和操作均有一定的要求。在目前已知的利用CRISPR检测的体系中，由于受到反应温度的影响，CRISPR体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后打开反应管再进行后续添加，这就极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，利用CRISPR体系结合核酸扩增技术，可以包括普通PCR扩增技术，快速PCR扩增技术，核酸等温扩增技术，如LAMP扩增以及RPA扩增技术等来实现对目标物进行快速特异性的可视化检测，并且在检测过程中可以避免由于添加CRISPR体系带来的气溶胶污染问题。在将CRISPR体系用于PCR、LAMP或RPA等扩增反应的可视化检测体系中，在反应液上覆盖足够厚的油相以隔绝在二次开盖添加CRISPR体系时核酸扩增反应液的弥散以及与外部的空气的直接接触，防止核酸扩增子整个检测扩增中的溢出而带来的气溶胶污染。本专利技术所涉及到的CRISPR系统结合PCR、LAMP或RPA可视化检测体系，可以在普通的紫外灯照射下就能直接用肉眼观察结果，也可用带有简单拍照或录像功能的手机等观测装置进行结果观察和记录。本专利技术不受限于复杂的荧光仪器，对于现场检测具有十分重大的意义，也可以应用与生命安全，农产品质量检测等众多方面。对于CRISPR体系与PCR结合的检测体系，在常规的PCR反应结束后，打开管盖，用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，盖上盖子，并通过简单的离心或者颠倒震荡等操作使之与底部的PCR反应体系混合。并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在这样的体系中，由于在反应液上覆盖有油相，反应液中的扩增子不会溢出或者飘散到空气中，因此不会造成气溶胶污染，从而解决了添加CRISPR体系所造成的污染问题。对于CRISPR体系与LAMP结合的检测体系，提供两种专利技术方案。其一，可以与上述提到的CRISPR体系与PCR反应结合的操作相似，在常规的LAMP反应结束后，打开管盖，用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，盖上管盖，并通过简单的离心或者颠倒震荡等操作使之与底部的LAMP反应体系混合。并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在这样的体系中，由于在反应液上覆盖有油相，反应液中的扩增子不会溢出或者飘散到空气中，因此不会造成气溶胶污染，从而解决了添加CRISPR体系时可能引起的污染问题。其二，也可以在反应前就将CRISPR体系添加到管盖上，将反应管置于LAMP反应的最适温度(65℃左右)进行反应，而添加在内上壁的CRISPR体系不会处于加热环境中，反应结束后，直接离心或者进行简单的颠倒震荡操作，使管盖上的CRISPR体系与底部的LAMP反应液混合，并将混合后的反应管置于37℃的条件下进行短暂反应，之后在简易紫外装置的照射下即可用肉眼判别检测结果。在采用上述其二这样的方案下，从LAMP反应的配置直至检测的终点，都无需二次打开反应管盖添加额外体系，彻底避免了扩增子溢出的防污染问题。对于CRISPR体系与RPA结合的反应，由于RPA本身的的反应温度也是37℃左右，与CRISPR体系的工作温度相当，在进行CRISPR结合RPA体系进行检测的时候，可以直接在反应起始时用移液枪将合适体积的CRISPR体系添加于管盖的内上壁，由于反应体积相对很小(一般≤20μL)，在表面张力的作用下，即使在倒置状况下，该小体积的反应体系也不会自然滴下而是会附着在内壁上(如附图1中的标号1)，无需待反应结束后二次开盖再加液，在这样的方案下，从RPA反应起始直至检测的终点，都无需再二次打开反应管盖，彻底避免了扩增子溢出的防污染问题。另一方面，本专利技术所涉及到的方法可以在最大程度减少仪器装置和操作的情况下完成。通过在反应液上覆盖一定体积的油相，(该油相不会对扩增反应造成任何影响)隔绝了扩增子与外部的环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于它将核酸扩增反应液置于反应管中，在核酸扩增反应液上覆盖油相层，进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应结束后，在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下，将合适体积的CRISPR体系加入反应管，通过离心作用，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察反应管，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。

【技术特征摘要】
1.一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于它将核酸扩增反应液置于反应管中，在核酸扩增反应液上覆盖油相层，进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应结束后，在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下，将合适体积的CRISPR体系加入反应管，通过离心作用，使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应，待反应到一定程度后，在紫外灯照射下，利用肉眼观察或摄像设备观察反应管，如果有荧光，则检查结果为阳性，否则为阴性。2.如权利要求1所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于所述油相采用生物油。3.如权利要求1所述的一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法，其特征在于所述方法采用离心或机械震荡，将油相层破碎，使核酸扩增子和CRISPR体系混合。4.一种快速可视化...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，钱程，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33