一种具有更高特异性的核酸扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种使用特异性寡核苷酸引物和对照物核苷酸来扩增核酸的具有更高特异性的方法。其中在第一扩增中，对照寡核苷酸使得能够序列特异性地打开扩增产物中的链。本发明专利技术还涉及一种用于实施本发明专利技术方法的相应试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种具有更高特异性的核酸扩增方法本专利技术涉及一种具有更高特异性的核酸扩增方法。本申请要求下列申请的优先权：欧洲专利申请EP18158722.1，2018年2月26日；EP18195312.6，2018年9月18日；EP18159337.7，2018年2月28日；德国专利申请102018001586.7，2018年2月28日。本文提及的这些和所有其他专利文件应被视为通过引用并入本说明书中(通过引用并入)。
技术介绍
核酸链的合成在当今的生物技术中具有核心地位。PCR等方法极大地推动了研究领域和工业应用领域(例如诊断学和食品工业)的发展。PCR与测序、实时检测、微阵列技术、微流控管理等技术的结合促进了技术的发展，并部分地克服了原有PCR的缺点。此外还开发了其他扩增方法，例如等温扩增技术。它们尤其适用于POCT(point-of-care-testing，即时检验)。尽管上述领域已取得了巨大进展，但PCR仍起着核心作用并因此确定了与其应用有关的各个技术壁垒。在所述扩增程序期间，在PCR中没有控制位于引物之间的扩增序列区段。PCR方法优化的重点是引物结合。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增核酸的方法(图56)，其中：/n·样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及与M1(反向)互补的序列M1’]，其中M在5’-3’方向包含连续的序列片段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，且在第一扩增步骤中与以下组分接触：/n·第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(尤其是镁离子)；/n·第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列片段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补[可基本上序列特异性地结合]的[...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180228 DE 102018001586.7;20180226 EP 18158722.1;1.一种用于扩增核酸的方法(图56)，其中：
·样品包含第一核酸聚合物，该第一核酸聚合物包含第一靶序列M1[以及与M1(反向)互补的序列M1’]，其中M在5’-3’方向包含连续的序列片段M1.5、M1.4、M1.3、M1.2和M1.1，且在第一扩增步骤中与以下组分接触：
·第一模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子(尤其是镁离子)；
·第一(右)寡核苷酸引物P1.1，其在5’-3’方向包含连续的序列片段P1.1.2和P1.1.1，其中P1.1.1具有与M1.1互补[可基本上序列特异性地结合]的[杂交]序列，而序列区段P1.1.2不能与M1[或相对于序列M1紧随3’方向上M1.1的序列]结合；
其中，P1.1(尤其是在区段P1.1.2中)包含修饰的核苷酸结构单元，使得P1.1.2不能用作第一模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
·第二(左)寡核苷酸引物P2.1，其与M1.5(基本)相同[并且能够序列特异性地与M1的反链上的M1.5的反向互补序列或P1.1的延伸产物P1.1-Ext(该处称为P1.1E1)结合]；以及
·对照寡核苷酸C1.2，其在5’-3’方向包含连续的序列片段C1.2.3、C1.2.2和C1.2.1，其中C1.2.3与M1的区段M1.2相同，且区段M1.2位于M1.1的5’方向上[并且在P1.1的聚合酶启动时首先被读取，因此C1.2.3可以与引物P1.1-Ext的聚合产物结合]，C1.2.2与P1.1.1互补(且与M1.1相同)，而C1.2.1与P1.1.2互补；
其中，C1.2含有在C1.2.1中修饰的核苷酸结构单元，因此C1.2.1不能用作模板依赖性核酸聚合酶活性的模板；
其中，所述样品在第二扩增步骤中与下列组分接触：
c)第三(右)寡核苷酸引物P3.1，其在3’末端包含序列区段3.1.1[或基本上由3.1.1组成]，且与M1的M1.1(反向)互补[可以与P2.1-Ext互补地结合]；
d)第四(左)寡核苷酸引物P4.1，其在3’末端包含序列区段4.1.1[或基本上由4.1.1组成]，且与M1的M1.5相同和/或基本相同[可以与P1.1-Ext互补地结合]；以及
e)第二模板依赖性核酸聚合酶(尤其是DNA聚合酶)，以及(可选地)模板依赖性核酸聚合酶的底物(尤其是核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸)和合适的辅因子。


2.如权利要求1所述的用于扩增核酸的方法，其中获得了第一引物延伸产物P1.1-Ext，其在5’-3’方向上除了序列区域P1.1.2和P1.1.1之外，还包括在5’-3’方向上包含序列片段P1.1E4、P1.1E3、P1.1E2和P1.1E1的合成区域，其中P1.1E4与靶序列M1的序列区段M1.2基本互补，P1.1E3与M1.3基本互补，P1.1E2与M1.4基本互补，以及P1.1E1与M1.5基本互补，并且得到第二引物延伸产物P2.1-Ext，其除了序列区域P2.1.1之外还包含合成区域P2.1-Ext，其与所述靶序列M1基本相同，且所述靶序列M1所在的区域与3’方向上的M1.5相邻；
其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，
以使P1.1-Ext可以与M1或P2.1-Ext形成双链，而P1.1-Ext可以与C1.2形成双链，并且P1.1-Ext与C1.2形成的所述双链优选于其与P2.1-Ext形成的所述双链。


3.如权利要求2所述的用于扩增核酸的方法，其中：
-选择所述第一扩增步骤的反应条件，以及/或者
-选择P1.1.2以及M1.4、M1.3、M1.2和M1.1(如果适用)的长度和/或解链温度，
以使在没有所述对照寡核苷酸C1.2的情况下，所述第一引物延伸产物P1.1-Ext根本或基本不与所述第二引物延伸产物P2.1-Ext分离。


4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述修饰的核苷酸结构单元包括2’-O-烷基核糖核苷结构单元，尤其是2’-O-甲基核糖核苷结构单元。


5.如前述权利要求之一所述的方法，其中所述第一扩增步骤基本上等温地进行，尤其是在20℃至50℃之间的温度下进行。


6.如前述权利要求之一所述的方法，其中进行所述第一扩增步骤，直至P1.1-Ext的拷贝数达到10至1e12，尤其是100至1e10，尤其是1000至1e8。


7.如前述权利要求之一所述的方法，其中P3.1和P4.1分别包含第二区域P3.1.2和P4.1.2；所述第二区域P3.1.2和P4.1.2分别与区域P3.1.1和P4.1.1的5’端相邻，且分别不与P1.1-Ext和P2.1-Ext互补。


8.如前述权利要求之一所述的方法，其中在所述第二扩增步骤期间，所述反应温度循环地升高和降低，尤其是在20℃与75℃之间的低温范围中以及85℃与105℃之间的温度范围中。


9.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述第一聚合酶和所述第二聚合酶是相同的。


10.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：
-P1.1和P3.1基本相同；以及/或者
-P2.1和P4.1基本相同。


11.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增和所述第二扩增在同一反应批次中进行。


12.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述第二聚合酶、所述第三寡核苷酸引物(P3.1)和/或所述第四寡核苷酸引物(P4.1)可被激活，以及/或者所述对照寡核苷酸可被灭活。


13.如前述权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于：所述第一扩增在第一反应批次中进行，所述第二扩增在第二反应批次中进行。


14.如权利要求9所述的方法，其特征在于：将所述第一反应批次或全部的第一反应批次的等分试样添加到所述第二反应批次中。


15.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于：所述对照寡核苷酸(C1.1)包含可序列特异性地与所述第三寡核苷酸引物(P3.2)结合的第四区域。
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【专利技术属性】
技术研发人员：德米特里·切尔科索夫，克里斯蒂安·格伦沃尔德，
申请(专利权)人：AGCT有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE