检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法技术

本发明专利技术提供一种检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，其特征在于，其包括：在以包含靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法
本专利技术涉及一种使用模板依赖性核酸扩增反应检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法。
技术介绍
作为检测DNA或RNA的1个～多个碱基的突变(插入、缺失或置换)、换言之检测与参考序列(例如野生型序列)的差异的方法，已知有如下所述的技术。(1)碱基序列确定突变的检测中通常利用确定分析对象的核酸序列，并将其与野生型序列进行比较的方法。作为测序方法，可使用桑格法(双脱氧法)、一系列的下一代测序方法(非专利文献1)等。由此，最终确定分析对象样品是否具有突变、或者具有怎样的突变。然而，该方法需要在从各个细胞中提取核酸并通过PCR法将该核酸序列扩增后，直接进行测序反应或者克隆于质粒等中后进行测序反应，例如在检测经基因组编辑的细胞或临床标本中的突变细胞时，会花费大量的时间和精力。因此，碱基序列确定至少不适合于筛选具有突变的细胞的目的。为了筛选的目的，需要可更简便地实施的方法。(2)使用了预测具有突变的DNA区域的引物的PCR法已报道了使用下述引物的PCR法：预测具有突变的野生型DNA区域的引物、及通过与该引物的结合而产生扩增产物的引物(非专利文献2、3、4)。该方法为利用可由野生型DNA生成PCR产物，而无法由具有突变的DNA生成扩增产物这一情况，对包含突变型DNA的样品进行检测的方法。该方法的突变检测原理为，体现出未生成扩增产物的阴性信号，然而却存在很多导致PCR反应难以进行的要素，因而多呈假阳性。因此，为了正确检测突变，必须对大量的样品进行分析。>(3)使用了TaqMan探针等荧光物质与猝灭剂修饰寡核苷酸探针的PCR法经常使用下述方法：通过将用荧光物质(探针的5’侧)与猝灭剂(探针的3’侧)修饰后的、针对预测具有突变的DNA区域的寡核苷酸探针添加至PCR反应体系，由此对具有突变的DNA进行检测(非专利文献5～7)。该方法基于下述原理：由于探针与野生型的模板DNA发生退火，因此探针因PCR中使用的DNA聚合酶的核酸外切酶活性而被切断，荧光物质与猝灭剂分离，结果在反应体系中产生荧光。由于探针不与具有突变的模板DNA发生退火，因此不会产生荧光。然而，该分析的实施中需要能够检测荧光的实时PCR循环仪或数字PCR装置。此外，在样品中混合存在野生型DNA与突变型DNA时，由于因样品中存在野生型DNA而产生荧光，因此难以用于这种杂合突变的检测。(4)Surveyor测定Surveyor测定通过将用PCR法进行了扩增的对照DNA与被测DNA在试验管内混合，进行热变性及再双链化，使用Surveyor核酸酶将错配碱基的3’侧切断，由此检测出被测DNA包含与对照DNA不同的碱基(非专利文献8)。该方法通常可在从细胞中提取核酸并用PCR法将该核酸序列扩增后实施。该方法比较简便，通过从进行了基因组编辑的细胞“群”中提取DNA而实施，主要用于检验基因组编辑的效率。此时，由于基因组编辑效率通常不是100％，而且基因组编辑方法也各式各样，因此没有必要引入对照DNA。然而，各个基因组编辑细胞的检测中，若不混合源自野生型细胞的DNA，则无法检测到同源的突变，因此必须混合源自野生型细胞的DNA。此外，进行源自单个细胞的分析时，上述碱基序列确定的技术更加直接，因此通常不使用Surveyor测定。(5)高分辨率熔解曲线分析技术(HRMA)该方法为通过对PCR产物的熔解曲线进行分析，由此对碱基序列的差异进行检测的方法(非专利文献9)。该分析可简便地进行，但需要用于检测熔解曲线的机器(实时PCR循环仪等)。(6)毛细管电泳该方法通过毛细管电泳对包含具有突变的区域的PCR产物进行分析，并精密地测定其长度，由此对碱基的插入或缺失进行检测(非专利文献10、11)。然而，该方法除了耗费时间和精力以外，还需要毛细管电泳装置，另外当碱基发生置换突变时，PCR产物的长度不变，因此无法检测到与野生型的差异。本申请的专利技术人开发了一种通过将同靶区域进行杂交的单链核酸添加至反应体系，从而特异性抑制靶区域的核酸扩增的方法，并申请了专利(专利文献1)。然而，专利文献1中没有记载检测靶核酸区域内的突变(与参考序列的差异)的方法，也没有动机将专利文献1的技术方案应用于核酸突变的检测。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2016-049107号公报非专利文献非专利文献1：Shendure,2012,NatureBiotechnology30,1084-1094非专利文献2：Harayama,2017,PLoSONE12(6):e0179165非专利文献3：Yu,2014,PLoSONE9(6):e98282非专利文献4：Hua,2017,J.Genet.Genomics,44(4),207-213非专利文献5：Mock,2015,NucleicAcidsRes.,43(11):5560-5571非专利文献6：Miyaoka,2014,Nat.Methods11(3):291-293非专利文献7：Findlay,2016,PLoSONE11(4):e0153901非专利文献8：Zhu,2014,ScientificReports4,6420非专利文献9：Dahlem,2012,PLoSGenet.,8(8):e1002861非专利文献10：Young,2015,NucleicAcidsRes.,43(9):e59非专利文献11：Ramlee,2015,Sci,Rep.5:15587
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题本专利技术的技术问题在于提供一种能够简便且低成本地检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法。进一步，其技术问题还在于提供一种能够检测1个以上的碱基的缺失、插入或置换的方法。解决技术问题的技术手段[1]一种检测方法，其为检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，所述检测方法的特征在于，其包括：在以包含所述靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同所述靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，所述单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。[2]根据所述[1]所述的检测方法，其中，靶核酸区域内的与参考序列的差异为参考序列中的1个以上的碱基的缺失、插入或置换。[3]根据所述[1]或[2]所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为选自由PCR法、RT-PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法、TMA法及RPA法组成的组中的任意一种。[4]根据所述[3]所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为PCR法。[5]根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测方法，其为检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，所述检测方法的特征在于，其包括：/n在以包含所述靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同所述靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，/n所述单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180420 JP 2018-0817521.一种检测方法，其为检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，所述检测方法的特征在于，其包括：
在以包含所述靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同所述靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，
所述单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，靶核酸区域内的与参考序列的差异为参考序列中的1个以上的碱基的缺失、插入或置换。


3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为选自由PCR法、RT-PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法、TMA法及RPA法组成的组中的任意一种。


4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为PCR法。


5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，PCR法包括变性步骤、退火步骤及延伸步骤。


6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，在相同温...

【专利技术属性】
技术研发人员：藤井穗高，藤田敏次，
申请(专利权)人：株式会社艾匹基乃龙，
类型：发明
国别省市：日本;JP