一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。本发明专利技术以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解后，以粪便裂解液作为模板，利用发明专利技术的巴布亚企鹅性染色体引物进行巢式PCR扩增，得到长度差异显著的CHD‑W/CHD‑Z片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。本发明专利技术具有对企鹅无损伤，准确性高并且操作简单等优点。

A Noninvasive Sex Identification Method for Papua Penguins

The invention discloses a non-invasive sex identification method for Papua penguins, which belongs to the field of life science. The invention takes the individual feces of Papua penguin as the source of DNA, and the excrement cleavages in the lysate, and takes the fecal lysate as a template. Using the Papua Penguin sex chromosome primer for nested PCR amplification, the CHD W/CHD Z fragment with significant length difference is obtained, and the amplified product is determined by agarose gel electrophoresis, and the sex of the tested penguin is determined according to the electrophoresis results. The invention has the advantages of no damage to penguins, high accuracy and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法
本专利技术涉及一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。
技术介绍
对于非平胸鸟类的性别鉴定，目前最准确的方法是分子鉴定法，该方法是利用位于性染色体上CHD基因(chromobox-helicase-DNAbindinggene，染色体螺旋蛋白基因)的内含子长度差异来判定性别，即如果扩增的CHD片段在Z/W染色体上有足够的长度差异，则雌性鸟类的扩增结果通过电泳应显示两条带，雄性则显示1条带。关于这一方法，国外学者先后总结了几对较为通用的CHD基因扩增引物(P1/P2，P2/P8，2550F/2718R)，这些引物对于大多数非平胸目鸟类都可以扩增得到产物，然而其产物在雌雄个体间差异是否显著，则因物种不同而异。巴布亚企鹅又称白眉企鹅，属于企鹅目，企鹅科。企鹅是单态鸟类，在其配对产卵前难以通过外形分辨雌雄。由于多数企鹅实行一夫一妻制，在执行珍稀动物保种计划或极地馆引种计划时，均希望按照一比一性比进行配对操作，因此，年幼企鹅的性别鉴定方法引起了人们的重视。前人总结的两对通用引物(P2/P8，2550F/2718R)已在多种企鹅中进行了可行性验证。然而，企鹅性别鉴定过程中，一般采用抽取血液或拔取多根羽毛以获得DNA样本，这两种方法对受检个体尤其是幼体会产生不良影响；同时，利用2550F/2718R引物进行扩增时，由于CHD-W与CHD-Z扩增产物之间的差异接近80bp(CHD-W扩增全长约为740bp)，这一结果导致企鹅性别鉴定时需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳才能清晰的区分性别。
技术实现思路
鉴于上述弊端，本专利技术的目的在于提供一种无损伤、准确性高且操作简单的巴布亚企鹅性别鉴定方法。本专利技术的技术方案包括以下具体步骤：刚排出体外的新鲜企鹅粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜企鹅粪便在裂解液中裂解，以粪便裂解液作为初始模板进行巢式PCR扩增，第二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。本专利技术利用裂解液裂解微量粪便直接充当被检个体DNA模板，这一方法省略了提取DNA所需操作，同时解决了微量样品提取DNA的低得率问题。裂解液组分(体积百分比)为：6％-8％蛋白酶K(20mg/L)溶液，0.4％-0.6％吐温-20，10％10×TaqBuffer，其余为纯水，TaqBuffer为后续PCR扩增时所用Buffer。裂解液中蛋白酶K使细胞膜蛋白水解；吐温-20可促使细胞破碎，进而使DNA释放；虽然不同厂家生产的不同种Taq都配有经过优化的、组分不尽相同的TaqBuffer，但其主要组分均为Tris-Hcl、KCl或NaCl和DTT等，这些组分与商品化的细胞裂解液组分相似，可以为蛋白酶K水解作用提供必要的离子环境。同时，使用本专利技术所述TaqBuffer配制裂解液可在后续的PCR反应液中扣除模板中所含TaqBuffer，避免引入商品化裂解液时模板中各组分对PCR反应的干扰，以保证PCR扩增的高效性和准确性。本专利技术利用裂解液裂解粪便的温度条件为：55℃维持20-30分钟后85℃维持15分钟。55℃为蛋白酶K最适反应温度，85℃则使蛋白酶K灭活以消除其对后续扩增的影响。本专利技术放弃使用非平胸鸟类通用引物，利用巴布亚企鹅CHD基因序列设计新引物，使PCR产物长度缩短，在提高PCR扩增效率的同时，增加了CHD-W/CHD-Z长度差异与CHD-W长度之比，使扩增产物仅需普通琼脂糖凝胶电泳即可清晰分辨雌雄。巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列是：正向引物：SEQIDNO.1：5`-GAACGTGGCAACAGAGTACTGA-3`；反向引物：SEQIDNO.2：5`-AGTTTAGGTTGGAAGGGACCTC-3`；第二次扩增引物的核苷酸序列是：正向引物：SEQIDNO.3：5`-ATGGTGAGGATGCTAGACATC-3`；反向引物：SEQIDNO.4：5`-GACCTCTGAAGGTCATCTWGTC-3`；本专利技术采用巢式PCR技术，第一次扩增以粪便裂解液为模板1，扩增出较长的目标片段。第二次扩增引物位于第一次扩增引物内侧，以第一次扩增得到的扩增产物为模板2，通过两次PCR使粪便中微量的消化道细胞目标基因得以充分扩增，同时通过两次扩增也增加了扩增特异性，减少非特异性产物出现。本专利技术中巢式PCR两次扩增反应体系除模板和引物不同外，其他组分均相同。下表为20μL反应体系，其中10×TaqBuffer比优化使用量减少0.1μL，是由于1μL模板中已经含有0.1μL10×TaqBuffer的组分(同理，巢式PCR第二次扩增体系中10×TaqBuffer使用量也为1.9μL)。除上述模板和10×TaqBuffer的使用量外，两次巢式PCR扩增反应体系应按照生产厂家提供的最优体系配置以使PCR扩增效率最大化。具体的，上述10×TaqBuffer为10×LaTaqBuffer或10×EXTaqBuffer。具体的，上述技术方案中所述10×TaqBuffer为10×LaTaqBuffer时，反应体系的其余试剂用量为：浓度为5U/μL的LaTaq0.2μL，2.5mMeach的dNTPMixture3.2μL，浓度为10μM的SEQIDNO.1/SEQIDNO.2或SEQIDNO.3/SEQIDNO.4各1μL，纯水11.7μL。具体的，上述技术方案中所述10×TaqBuffer为10×EXTaqBuffer时，反应体系的其余试剂用量为：浓度为5U/μL的LaTaq0.1μL，2.5mMeach的dNTPMixture1.6μL，浓度为10μM的SEQIDNO.1/SEQIDNO.2或SEQIDNO.3/SEQIDNO.4各0.8μL，纯水13.8μL。具体的，巢式PCR第一次扩增反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性25s，55-57℃退火25s，72℃延伸25s，28-34个循环；巢式PCR第二次扩增反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性25s，54-56℃退火25s，72℃延伸25s，36-40个循环；72℃终延伸60s。本专利技术利用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。具体的，若被检个体巢式PCR扩增产物为两条带(W带385bp，Z带281bp)，表示该个体CHD基因为W/Z型，该个体判断为雌性；若被检个体PCR扩增产物为一条带(Z带281bp)，表示该个体CHD基因为Z/Z型，则判断性别为雄性。专利技术有益效果1.本专利技术利用巴布亚企鹅粪便中带有的少量消化道细胞作为DNA扩增模板，进行性别鉴定的方法，省略了提取DNA所需操作，同时解决了微量样品提取DNA的低得率问题；2.本专利技术采用10×TaqBuffer配制裂解液，可在后续的PCR反应液中扣除模板中所含TaqBuffer，避免引入商品化裂解液时模板中各组分对PCR反应的干扰，以保证PCR扩增的高效性和准确性；3.通过设计新引物以缩短产物长度，增加CHD-W/CHD-Z长度差异与CHD-W长度之比，使扩增结果仅需普通琼脂糖凝胶电泳即可清除分辨雌雄；4.提供一种无损伤，准确性高并且操作简单的巴布亚企鹅性别鉴定的方法。附图说明图1为实施例1中利用本方法进行16只巴布亚企鹅性别鉴定结果，其中第1泳道和第18泳道为100bpMar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解，所用裂解液组分体积百分比为6％‑8％蛋白酶K，0.4％‑0.6％吐温‑20，10％的10×Taq Buffer，余量为纯水；(2)以粪便裂解液作为模板1进行巢式PCR第一次扩增，再以第一次扩增得到扩增产物为模板2进行巢式PCR第二次扩增，得到特异性扩增产物；(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判定被检企鹅性别，若被检个体巢式PCR扩增产物为两条带则判断为雌性，一条带则判断性别为雄性；步骤(2)中所述的巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所述的巢式PCR第二次扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解，所用裂解液组分体积百分比为6％-8％蛋白酶K，0.4％-0.6％吐温-20，10％的10×TaqBuffer，余量为纯水；(2)以粪便裂解液作为模板1进行巢式PCR第一次扩增，再以第一次扩增得到扩增产物为模板2进行巢式PCR第二次扩增，得到特异性扩增产物；(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判定被检企鹅性别，若被检个体巢式PCR扩增产物为两条带则判断为雌性，一条带则判断性别为雄性；步骤(2)中所述的巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；步骤(2)中所述的巢式PCR第二次扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。2.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的企鹅粪便为刚排出体外的新鲜粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜粪便。3.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的企鹅粪便的用量为2-20mg。4.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫东，田甲申，张胜久，鲍相渤，鹿志创，杜静，韩家波，李艳秋，刘明，刘有林，王京瑞，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，大连圣亚旅游控股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21