一种缩宫素的精制方法技术

本发明专利技术公开了一种缩宫素的精制方法，该精制方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；缩宫素粗品溶液为固相合成的还原型缩宫素粗品溶液经氧化后而得；高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料。本发明专利技术运用了在线反相富集、反相转盐、反相纯化一步法制得多肽纯品，优化了生产工艺，其中柱平衡、上样富集和转盐阶段的流动相为水溶液，环保无污染，流出的废液可直接进行污水处理并回收利用。

A Refining Method of Oxytocin

【技术实现步骤摘要】
一种缩宫素的精制方法
本专利技术涉及一种缩宫素的精制方法。
技术介绍
缩宫素，又称催产素，英文名为Oxytocin，结构式：分子式为：C43H66N12O12S2，分子量为1007.19缩宫素用于引产、催产、产后及流产后因宫缩无力或缩腹不良而引起的子宫出血；了解胎盘储备功能(催产素激怒试验)；滴鼻可促使排乳。缩宫素能间接刺激子宫平滑肌收缩，模拟正常分娩的子宫收缩作用，导致子宫颈扩张，子宫对缩宫素的反应在妊娠过程中逐渐增加，足月时达高峰。缩宫素也可刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到目标多肽缩宫素分子量约1kDa，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kDa蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。采用固相合成+稀释环化得到的缩宫素粗品溶液浓度均比较稀，采用一般的反相色谱柱进行纯化时，仅上样的过程中就产生大量的有机废液，危废的处理费用很高。现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的适合纯化低浓度多肽及盐的经济有效的工艺。中国专利文献CN106674332A公开了一种缩宫素的制备方法。该制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为硅胶C18；所述的缩宫素前体粗品为含两游离巯基的缩宫素前体粗品。该专利的制备工艺中采用还原型的缩宫素前体粗品为起始原料，不仅在色谱柱上进行环化时需大量的含有机溶剂的流动相而且在纯化和转盐步骤中也产生了大量的有机危废液，后续废液的处理成本较大。中国专利文献CN1990501A公开了一种固相合成缩宫素的方法，该方法以RinkAmide或RinkMBHA树脂为起始原料，以TBTU/HOBt或HABU/HOBt为缩合剂，逐步合成；然后切割，用空气或用双氧水在(10-3～10-4mol/L)溶液进行氧化，易发生分子间反应生成线性或环状的二聚和多聚体，这种方法的缺点在于肽分子间的低聚反应易造成环肽产率和纯度的严重降低，且该方法的制备工艺中流动相均为含有机溶剂，产生的危废液处理成本高难以回收利用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中产生的危废液量大，均为有机危废液，造成的废液处理成本大，不经济的缺陷，而提供了一种缩宫素的精制方法。本专利技术的缩宫素的精制方法在纯化目标产物的过程中产生的废液大部分为废水可经污水处理可直接回用，经济环保。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本专利技术提供了一种缩宫素的精制方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步反相洗脱过程中完成，所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：其中，流动相A为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/水，流动相B为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/乙腈，样品C1为所述的缩宫素粗品溶液，流动相C2为5～50mMNH4Ac-NH4OH水溶液，所述流动相C2的pH为7.0～9.0，流速为80～100ml/min；收集保留时间为95～105min的洗脱液即得缩宫素溶液。本专利技术中，所述的缩宫素粗品溶液为固相合成的还原型缩宫素粗品经溶解、稀释、氧化而得。所述的缩宫素粗品溶液的具体制备步骤如下：以RinkAmideMBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；加入切肽试剂进行切肽，加入甲基叔丁基醚进行沉淀，得还原型缩宫素粗品；将还原型缩宫素粗品用50％乙酸/水溶解，再用水稀释，即为还原型缩宫素粗品溶液；用碱性物质将所述的还原型缩宫素粗品溶液的pH调节至7.0-9.0，加入浓度为30％的双氧水进行氧化，其中每克还原型缩宫素粗品加0.5ml30％的双氧水，得氧化型缩宫素粗品溶液，即为缩宫素粗品溶液。其中，50％乙酸/水可充分的溶解所述的还原型缩宫素粗品。其中，所述的还原型缩宫素粗品溶液的浓度为0.1～4mg/ml，较佳地为0.5～2mg/ml。其中，所述的切肽试剂为本领域常规，较佳地为体积比为90:7.5:2.5的TFA/TIS/H2O。其中，所述的碱性物质为本领域常规，较佳地为NaOH。本专利技术中，所述缩宫素粗品溶液中缩宫素的结构式为所述的缩宫素粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液。本专利技术中，所述的超耐水填料为ODS-AQ超耐水填料。本专利技术中，所述超耐水填料的孔径为7～10nm，粒径为10μm。在某一较佳实施方式中，运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为ODS-AQ超耐水填料，孔径10nm，粒径10μm，装填至柱床压力为1000psi，采用Varian色谱装填系统，300g干粉状的ODS-AQ超耐水填料，600mL异丙醇搅拌匀浆后，倒入内径50mm的Load&Lock4002制备柱，压缩比为1.5:1，载气为N2，调节所述载气压力使得油压表压力为1500psi，动态轴向压缩至柱床高度25cm，作为反相富集、反相转盐和反相纯化方案所用的制备柱。本专利技术中，所述的高效液相反相色谱法的检测波长为220nm。本专利技术中，所述的流动相A为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/水溶液；和/或，所述的流动相B为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/乙腈；和/或，所述的流动相C2为10～20mMNH4Ac-NH4OH水溶液；和/或，所述的流动相C2的pH为7.5～8.5；和/或，所述的缩宫素粗品溶液的HPLC纯度为60～85％，较佳地为70％～85％，更佳地为70％～80％；和/或，所述的收集保留时间为98～101min的洗脱液即为缩宫素溶液。本专利技术中，在50～51min期间，将所述的洗脱液由样品C1完全更换为流动相C2；在71～72min期间，将所述的洗脱液由流动相C2完全更换为流动相A。依照本领域常规，上述时间区间不应理解为对洗脱条件的限定，时间长短可依高效液相色谱仪厂家型号的不同进行相应调整。本专利技术中，步骤(5)结束后的115～116min内，将所述的洗脱液从80％流动相A匀速降低至50％流动相A，相应的匀速增加流动相B至50％，在116～125min内保持50％流动相A+50％流动相B洗脱，以达到清洗色谱柱的目的。其中，所述的反相富集为洗脱步骤(1)，所述的反相转盐为步骤(2)～(3)，具体地，步骤(2)是用弱碱NH4Ac-NH4OH去除缩宫素粗品中的三氟乙酸根的过程，步骤(3)是去除步骤(2)中的铵根离子的过程，所述的反相纯化为步骤(4)和(5)，其中，步骤(4)是去除较弱的吸附杂质的过程。本专利技术中，所述的洗脱步骤(4)和(5)中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缩宫素的精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步反相洗脱过程中完成，所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：

【技术特征摘要】
1.一种缩宫素的精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步反相洗脱过程中完成，所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：其中，流动相A为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/水，流动相B为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/乙腈，样品C1为所述的缩宫素粗品溶液，流动相C2为5～50mMNH4Ac-NH4OH水溶液，所述流动相C2的pH为7.0～9.0，流速为80～100ml/min；收集保留时间为95～105min的洗脱液即得缩宫素溶液。2.如权利要求1所述的缩宫素的精制方法，其特征在于：所述的缩宫素粗品溶液为固相合成的还原型缩宫素粗品经溶解、稀释、氧化而得。3.如权利要求1所述的缩宫素的精制方法，其特征在于：所述的还原型缩宫素粗品经溶解、稀释得还原型缩宫素粗品溶液，所述的还原型缩宫素粗品溶液中还原型缩宫素粗品的浓度为0.1～4mg/ml，较佳地为0.5～2mg/ml；溶解所述还原型缩宫素粗品的溶剂为体积百分比为50％的乙酸/水溶液。4.如权利要求1所述的缩宫素的精制方法，其特征在于：所述缩宫素粗品溶液中缩宫素的结构式为所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：江锡铭，朱鑫磊，王振平，丁金国，黄臻辉，
申请(专利权)人：上海上药第一生化药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31