一种卡贝缩宫素的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种合成卡贝缩宫素的纯化方法，该方法包括了反相离子对液相色谱纯化合成粗肽，通过离子交换树脂将离子对试剂脱除，最终得到纯度为99.5%的卡贝缩宫素精肽。反相离子对液相色谱的运用，大大提高了纯化收率和产品纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽的纯化
，尤其涉及卡贝缩宫素的纯化技术。
技术介绍
卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在两分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约一个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素要长，并且对有出血倾向、需额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性好，与缩宫素一样有效甚至更有效。目前临床常用的促进子宫缩收药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高血压和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱相比，使用卡贝缩宫素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著降低。因此，卡贝缩宫素在临床应用上，具有广阔的市场前景。卡贝缩宫素常用纯化方法通常包括反相高效液相色谱法、凝胶法、离子交换法等，采用任何一种单一方法，都很难分离得到高纯产品(< 99%)，或者收率较低(小于50%)。目前，很少有关于其分离纯化方面的研究报道，程生强，马亚平等在其研究中报道，以磷酸缓冲液作为洗脱液，采用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，并采用离子交换法转盐，得到醋酸卡贝缩宫素，收率为70%-75%，目的肽纯度为98%。综合分析国内外关于合成卡贝缩宫素的纯化方法，主要存在两点问题①采用单一的纯化方法，产品纯度低；②采用多种纯化手段，产品收率低。
技术实现思路
本专利技术针对现有工艺的不足，提出一种卡贝缩宫素的分离纯化方法，产品纯度高，纯化收率高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案采用反相离子对液相色谱法，将反相色谱和离子色谱的优势结合起来，减少纯化步骤，提高产品纯度，其方法包含以下步骤步骤一、采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为5-40%,优选25%-35%，分三段收集目的峰，分别为峰前、合格品、峰后，合格品为纯度达到99. 5%部分，峰前部分保留时间小于合格品的保留时间，纯度为90. 0%-99. 5%，峰后部分保留时间大于合格品的保留时间，纯度为90. 0%-99. 5%。步骤二、将以上①步得到峰前、峰后部分分别纯化，采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为5-40%，优选25%-35%，将得到的合格品合并，得到纯度为99. 5%以上的目的肽。步骤三、将以上得到的合格品，采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度的补偿离子水溶液为A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为10-80%,优选30%-70%，将得到的合格品合并，得到纯度为99. 5%以上的目的肽。 将洗脱液添加补偿离子，包括醋酸、磷酸、盐酸、三氟乙酸等，得到不同盐形式的卡贝缩宫素。与已有工艺相比，本专利技术操作简单，一步纯化达到99. 5%的纯度，收率达到70%-75%，具有明显的成本优势。具体实施例方式本文所述，术语“反相离子对色谱法”指以反相填料为固定相，离子对试剂为流动相的色谱行为，或者是以离子交换填料为固定相，有机溶剂为流动相的色谱行为，目的是结合离子色谱和反相色谱的优势，高效分离纯化合成卡贝缩宫素。本文所述，术语“离子对试剂”包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R选自甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊基、壬基、癸基、十一烧基、十_■烧基、十二烧基、十四烧基、十五烷基、十六烷基。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本专利技术的保护范围有任何的限制作用。实施例I : I、预处理将待纯化卡贝缩宫素配制成浓度为200-300mg/ml的水 溶液，经孔径为O. 45um的微孔滤膜过滤，收集滤液。反相色谱柱预处理使用60%的乙腈水溶液冲洗色谱柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。离子交换色谱柱预处理浓度为2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用纯水洗至中性。2、分离纯化取滤液，注入处理好的色谱柱进行分离纯化，对目的洗脱 液划分峰为前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分纯度90%-99. 5%，合格品部分纯度大于99. 5%，峰后部分纯度90%-99. 5% ;分别将峰前、峰后部分洗脱液分离纯化，色谱条件与原始样品的分离纯化相同。合并合格品，备用。分离纯化色谱条件色谱柱以反相C18为固定相的色谱柱，柱子规格为50mmX 250mm ;流动相A相10mmol/L的庚烧磺酸钠,磷酸调pH至2. O ,流动相B相乙腈，流速为80ml/min ;梯度以乙腈浓度计，25%-35%，时间为40min ;检测波长为220nm ;上样量 l_1.2g 3、脱盐、干燥将经分离纯化后卡贝缩宫素合格品注入预处理好的色谱柱，梯度洗脱，收集目的肽；将脱盐后的卡贝缩宫素目的肽浓缩至120-150mg/ml，低温冷冻干燥得到冻干粉。产品纯度为99. 7%，收率为72. 8%。脱盐色谱条件色谱柱阳离子交换树脂普尔树脂D201，柱子直径和长度50mmX 400mm;流动相A相0· 1%的醋酸水溶液，流动相B相乙醇；洗脱梯度以乙醇浓度计，30-70%，时间为70min;检测波长为220nm ;上样量4. 5-5. Ogo实施例2 I、预处理将待纯化卡贝缩宫素配制成浓度为200-300mg/ml的水 溶液，经孔径为O. 45um的微孔滤膜过滤，收集滤液。 反相色谱柱预处理使用60%的乙腈水溶液冲洗色谱柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。离子交换色谱柱预处理浓度为2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用纯水洗至中性。2、分离纯化取滤液，注入处理好的色谱柱进行分离纯化，对目的洗脱 液划分峰为前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分纯度90%-99. 5%，合格品部分纯度大于99. 5%，峰后部分纯度90%-99. 5% ;分别将峰前、峰后部分洗脱液分离纯化，色谱条件与原始样品的分离纯化相同。合并合格品，备用。分离纯化色谱条件色谱柱以反相C18为固定相的色谱柱，柱子规格为50mmX250mm;流动相A相lOmmol/L的十二烷基磺酸钠，磷酸调pH至2. O，流动相B相乙腈，流速为80ml/min ;梯度以乙腈浓度计，25% -35%，时间为40min ;检测波长为220nm ；上样量1-1. 2g 3、脱盐、干燥将经分离纯化后卡贝缩宫素合格品注入预处理好的色谱柱，梯度洗脱，收集目的肽；将脱盐后的卡贝缩宫素目的肽浓缩至120-150mg/ml，低温冷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：①、采用反相离子对液相色谱法分离纯化卡贝缩宫素粗肽：以反相色谱填料为固定相，一定浓度的离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，纯化后得到纯度为99.5%以上的精肽；②、采用离子交换色谱法脱除精肽中离子对试剂及其它盐：将精肽溶液调至合适pH，使得卡贝缩宫素结合在离子交换树脂上，用纯水冲洗除去无机盐和大部分离子对试剂，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脱，将离子对试剂和卡贝缩宫素分开，得到无盐卡贝缩宫素乙醇水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤 ①、采用反相离子对液相色谱法分离纯化卡贝缩宫素粗肽以反相色谱填料为固定相，一定浓度的离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，纯化后得到纯度为99. 5%以上的精肽、采用离子交换色谱法脱除精肽中离子对试剂及其它盐将精肽溶液调至合适PH，使得卡贝缩宫素结合在离子交换树脂上，用纯水冲洗除去无机盐和大部分离子对试剂，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脱，将离子对试剂和卡贝缩宫素分开，得到无盐卡贝缩宫素乙醇水溶液。2.如权利要求I所述方法，其特征在于所述反相色谱填料包括C18、C8、C4，但不仅限于 C18、C8、C4。3.如权利要求I所述方法，其特征在于所述离子对试剂包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R选自甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈阿娜，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：