一种加压素[+Gly]杂质的精制方法技术

本发明专利技术公开了一种加压素[+Gly]杂质的精制方法。加压素[+Gly]杂质的精制方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成。本发明专利技术加压素[+Gly]杂质的精制方法在纯化的过程中产生的废液大部分为废水，可经污水站简单处理就可以重复利用，经济环保。

A Refining Method of Vasopressin [+Gly] Impurity

【技术实现步骤摘要】
一种加压素[+Gly]杂质的精制方法
本专利技术涉及一种加压素[+Gly]杂质的精制方法。
技术介绍
加压素是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为加压素的理论分子量1084.24。属于神经垂体激素，又叫血管升压素或后叶加压素，它有两种受体V1和V2。V1主要分布在血管平滑肌细胞膜上，通过受体-G蛋白-第二信使途径发挥作用，使血管收缩，血压升高。V2在肾脏远端小管和集合管上皮细胞，生理剂量可以促进肾脏远端小管和集合管对水的重吸收，发挥抗利尿作用。就一个药品而言，其中所含的少量杂质是引发药品副作用最重要的原因，因此对其纯度的检查是保证药品安全有效性的重要基础之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”的检查研究。多肽类药物的“有关物质”主要来自合成多肽类药物过程中的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等杂质，尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是“有关物质”的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。研究表明合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺和肽链C段酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下)。其中，加压素[+Gly]杂质是加压素在合成过程中常见的杂质，该杂质可以在加压素质量检测中作为杂质对照品，因此，制备纯度高的加压素[+Gly]杂质对加压素质量控制具有重要意义。目前多肽物质常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到目标多肽加压素[+Gly]杂质的分子量约1kDa，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kDa蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。采用固相合成+稀释环化得到的加压素[+Gly]杂质粗品溶液浓度均比较稀，采用一般的反相色谱柱进行纯化，仅上样的过程中就产生大量的有机废液，不能直排或经污水站简单处理就可以重复利用，尤其是低浓度的样品纯化处理，废液量更大，危废的处理费用很高。因此，迫切需要开发新的适合纯化低浓度多肽及盐的经济有效的工艺。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中加压素[+Gly]杂质的精制过程中产生大量有机废液，且危废液量大，造成的废液处理成本高，不经济的缺陷，而提供了一种加压素[+Gly]杂质的精制方法。本专利技术的精制加压素[+Gly]杂质的方法在纯化目标产物的过程中产生的废液大部分为废水，经污水处理可直接回用，经济环保。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本专利技术提供了一种加压素[+Gly]杂质的精制方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：收集保留时间为75～85min的洗脱液即得到加压素[+Gly]杂质溶液；所述的流动相A为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/水溶液，所述的流动相B为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/乙腈，所述的样品C1为所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液，所述的流动相C2为5～50mMNH4Ac-NH4OH水溶液，所述的流动相C2的pH为7.0～9.0，所述的洗脱液的流速为80～100mL/min。本专利技术中，在20～21min期间，将所述的洗脱液由所述的样品C1更换为所述的流动相C2；在41～42min期间，将所述的洗脱液由所述的流动相C2更换为所述的流动相A；依照本领域常规，上述时间区间不应理解为对洗脱条件的限定，时间长短可依高效液相色谱仪厂家型号的不同进行相应调整。本专利技术中，所述的洗脱步骤(4)中匀速变化的过程为每分钟在原洗脱液的基础上增加2％所述的流动相B，同时相应减少2％所述的流动相A。所述的洗脱步骤(5)中所述匀速变化的过程为每分钟在原洗脱液的基础上增加0.333％所述的流动相B，同时相应减少0.333％所述的流动相A。所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液为采用固相合成法制得的还原型加压素[+Gly]杂质粗品先经过溶解、稀释为还原型加压素[+Gly]杂质粗品溶液，再将所述的还原型加压素[+Gly]杂质粗品溶液经氧化过程而得。所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液的具体制备步骤如下：以RinkAmideMBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；加入切肽试剂进行切肽，加入甲基叔丁基醚进行沉淀，得还原型加压素[+Gly]杂质粗品；将所述的还原型加压素[+Gly]杂质粗品经溶解、稀释，得还原型加压素[+Gly]杂质粗品溶液；用碱性物质将所述的还原型加压素[+Gly]杂质粗品溶液的pH调节至7.0-9.0，加入浓度为30％的双氧水进行所述的氧化过程，每克还原型加压素[+Gly]杂质粗品加0.5mL的30％的双氧水，得氧化型加压素[+Gly]杂质粗品溶液，即为所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液。其中，所述的切肽试剂可为本领域常规，较佳地为体积比为90：7.5：2.5的TFA/TIS/H2O。所述的溶解可为本领域常规，较佳地用体积百分比为50％的乙酸/水溶液进行溶解。所述的稀释可为本领域常规，较佳地用水稀释。所述的氧化过程可为本领域常规，较佳地用碱性物质将所述的还原型加压素[+Gly]杂质粗品溶液的pH调节至7.0-9.0，加入体积百分比为30％的双氧水进行氧化过程。所述双氧水的用量为0.5mL/1g还原型加压素[+Gly]杂质粗品。其中，所述的碱性物质可为本领域常规，较佳地为NaOH。本专利技术中，所述的还原型加压素[+Gly]杂质粗品的溶液浓度为0.1～4mg/mL，较佳地为0.5～2mg/mL，例如，0.8mg/mL、1mg/mL和1.5mg/mL。本专利技术中，所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的加压素[+Gly]杂质的HPLC纯度为60％～85％，较佳地为70％～80％。本专利技术中，所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液中所述的加压素[+Gly]杂质的结构式为所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液中的溶剂为含三氟乙酸和乙酸的水溶液。本专利技术中，所述的流动相A较佳地为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/水溶液。所述的流动相B较佳地为体积百分比为0.02～0.05％的乙酸/乙腈。所述的流动相C2较佳地为10～20mMNH4Ac-NH4OH水溶液。所述的流动相C2的pH较佳地为7.5～8.5。所述的高效液相反相色谱法的检测波长为220nm。本专利技术中，所述的超耐水填料的孔径较佳地为7～10nm，所述的超耐水填料的粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种加压素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：

【技术特征摘要】
1.一种加压素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素[+Gly]杂质粗品溶液依次进行反相富集、反相转盐、反相纯化，即可；所述的高效液相反相色谱法的填料为超耐水填料；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化均是在一步的反相洗脱过程中完成；所述的反相富集、反相转盐、反相纯化的条件如下：收集保留时间为75～85min的洗脱液即得到加压素[+Gly]杂质溶液；所述的流动相A为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/水溶液，所述的流动相B为体积百分比为0.005～0.1％的乙酸/乙腈，所述的样品C1为所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液，所述的流动相C2为5～50mMNH4Ac-NH4OH水溶液，所述的流动相C2的pH为7.0～9.0，所述的洗脱液的流速为80～100mL/min。2.如权利要求1所述的加压素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：在20～21min期间，将所述的洗脱液由所述的样品C1更换为所述的流动相C2；在41～42min期间，将所述的洗脱液由所述的流动相C2更换为所述的流动相A。3.如权利要求1所述的加压素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：洗脱步骤(4)和(5)中，所述的洗脱液的转换速率是一个匀速变化的过程。4.如权利要求1所述的加压素[+Gly]杂质的精制方法，其特征在于：所述的加压素[+Gly]杂质粗品溶液为采用固相合成法制得的还原型加压素[+Gly]杂质粗品先经过溶解、稀释为...

【专利技术属性】
技术研发人员：江锡铭，朱鑫磊，丁金国，黄臻辉，
申请(专利权)人：上海上药第一生化药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31