mmu-miR-183-5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种微小RNA——mmu‑miR‑183‑5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用。本发明专利技术通过微小RNA表达谱微阵列实验及生物信息学方法筛选出调控子宫容受阶段并且在着床位点起关键作用的微小RNA：mmu‑miR‑183‑5p，经试验证明mmu‑miR‑183‑5p对胚胎着床有极其显著的抑制作用，提示其可作为避孕药物使用，为新药筛选提供了新的途径。

Application of mmu-mir-183-5p in the preparation of drugs for inhibiting embryo implantation

【技术实现步骤摘要】
mmu-miR-183-5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用(一)
本专利技术涉及mmu-miR-183-5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用。(二)
技术介绍
miR-183家族由miR-96、miR-182及miR-183三种miRNA组成，在结构上具有高度保守性。通过miRBase查询比对发现，miR-183-5p在不同物种中具有高度保守性，人源的miR-183-5p与鼠源的miR-183-5p的一致性达到了100％。该家族在消化系统、泌尿生殖系统、呼吸系统等多种肿瘤中表达异常。已报道的研究证实，miR-183能够促进细胞的迁移、侵袭、分化、增殖，还间接影响了微血管的生成。而在胚胎着床过程中，也发生迁移、分化、增殖、微血管形成等生理过程，子宫内膜上皮细胞与胚胎之间会进行相互侵入，细胞增殖分化，胚胎滋养层侵入子宫内膜上皮，微血管生成。虽然已经证实了miR-183在肿瘤细胞的迁移、分化、增殖、微血管形成中的作用，但尚无文献证实其在胚胎着床过程中的作用。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供mmu-miR-183-5p在抑制胚胎着床的药物中的应用。本专利技术采用的技术方案是：微小RNAmmu-miR-183-5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用。具体的，所述mmu-miR-183-5p序列如下：5’-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU-3’。优选的，所述mmu-miR-183-5p经分子修饰获得的更稳定的双链小RNA用于制备所述药物，具体的，所述分子修饰为：全部碱基甲基化修饰+5'端前3个碱基UAU和3'端前4个碱基CACU之间进行硫代修饰+3'末端进行胆固醇修饰。与未经修饰的双链小RNA相比，修饰后的RNA与细胞膜亲和力更高，细胞转染实验转染试剂用量显著减少，特别适合动物体内干扰实验，并且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果，可以采用全身注射或局部注射等多种方式给药，操作简便。进一步，所述药物为避孕药物。具体的，所述药物制成注射用制剂，通过注射到受体子宫达到抑制胚胎着床的作用。本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术提供了mmu-miR-183-5p在抑制胚胎着床的药物中的应用，经试验证明mmu-miR-183-5p对胚胎着床有极其显著的抑制作用，提示其可作为避孕药物使用，为新药筛选提供了新的途径。(四)附图说明图1为D1、D4、D5IMS、D5IIS子宫内膜中mmu-miR-183-5p的变化趋势；图2为miR-183家族在人/鼠染色体上的位置关系；图3为小鼠不同发情阶段的阴道涂片结果：A：发情前期；B：发情期；C：发情后期；D：间情期；图4为qPCR法验证差异表达mmu-miR-183-5p的变化；图5为假孕模型中mmu-miR-183-5p的变化；图6为延时模型与延时激活模型中mmu-miR-183-5p的相对含量柱状图；图7为注射mmu-miR-183-5p后对小鼠胚胎着床数的影响；A为注射mmu-miR-183-5p实验组，左侧为注射DEPC水对照，右侧为注射mmu-miR-183-5pagomir；B为对照组，左侧注射DEPC水做对照，右侧注射NegativeControl做对照。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：一、小RNA测序1.取材ICR小鼠品系，于晚上17点选取发情的母鼠与公鼠进行合笼，第二天早上9点验栓，如果母鼠阴道口出现白色栓状物，证明母鼠已经受孕，记做怀孕D1天。收集妊娠后第一天(D1)，第四天(D4)，第五天着床位点(D5IMS)和非着床位点(D5IIS)的子宫内膜组织：收集方法为，在相应的天数内，上午十点通过断颈法人道处死小鼠，使用75％的酒精进行消毒，然后取出小鼠的子宫组织，去除黏连的脂肪和血管，洗去附着的血液，通过挤压剥离法分离小鼠的子宫内膜。分别获得妊娠后第一天(D1)，第四天(D4)，第五天着床位点(D5IMS)和非着床位点(D5IIS)的子宫内膜组织。2.组织miRNA抽提miRNA抽提操作步骤：(TIANGEN试剂盒；此方法用于对miRNA的纯度要求较高，比如在研究miRNA芯片、miRNA克隆时使用。)(1)样品处理：将组织在液氮中磨碎。每30～50mg动物组织或者100mg植物组织加1mL裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的十分之一。(2)将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。(3)4℃12,000rpm(～13,400×g)离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。(5)4℃12,000rpm(～13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。(6)量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇(如：500μL的转移液加215μL无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入向吸附柱miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉向吸附柱miRspin，保留流出液。(7)量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇(如：700μL的流出液加525μL无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱miRelute中，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。(8)向吸附柱miRelute中加入500μL去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。(9)向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。(10)重复操作步骤9。(11)将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心1min，去除残余液体。离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。(12)将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free1.5mL离心管中，加20μLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min。3.小RNA测序及结果分析送生物公司进行小RNA测序，妊娠后第一天(D1)，第四天(D4)，第五天着床位点(D5IMS)和非着床位点(D5IIS)的子宫内膜组织miRNA各三个生物重复。通过对测序结果的分析，找出在着床窗口期起关键作用的miRNA。结果显示，在胚胎着床过程中，mmu-miR-183-5p在着床前后有着极其显著的差异。小鼠组织miRNA测序结果中mmu-miR-183-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微小RNA mmu‑miR‑183‑5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.微小RNAmmu-miR-183-5p在制备抑制胚胎着床的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述mmu-miR-183-5p序列如下：5’-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU-3’。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述mmu-miR-183-5p经...

【专利技术属性】
技术研发人员：王争光，曹丁壬，梁晶婕，邱寒峰，谭强，施爽，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33