β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学领域,涉及β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用，本发明专利技术进行了β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ对肿瘤血管生成的影响实验，结果显示，下调胶质瘤起始细胞中β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞的成瘤能力，抑制胶质瘤组织中的血管密度；下调胶质瘤起始细胞中β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞向血管内皮细胞的分化。进一步，所述的β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ的下调可以用于制备抗胶质瘤血管生成制剂，为抑制胶质瘤血管形成提供新的有效手段，以及可以作为肿瘤病人预后的一个指标。

Application of beta 1,4-galactosyltransferase V interfering nucleic acid in preparation of anti-glioma angiogenesis agents

The present invention belongs to the field of biomedicine and relates to the application of beta 1,4 galactosyltransferase V in the preparation of anti-glioma angiogenesis preparations. The effects of beta 1,4 galactosyltransferase V on angiogenesis of glioma have been experimented. The results show that downregulation of beta 1,4 galactosyltransferase V in glioma initiating cells can inhibit the tumorigenesis of glioma initiating cells. Inhibition of vascular density in glioma tissue and down-regulation of beta 1,4 galactosyltransferase V in glioma initiating cells can inhibit the differentiation of glioma initiating cells into vascular endothelial cells. Furthermore, the down-regulation of beta 1,4 galactosyltransferase V can be used to prepare anti-glioma angiogenesis agents, provide a new effective means for inhibiting glioma angiogenesis, and can be used as an indicator of prognosis of patients with glioma.

【技术实现步骤摘要】
β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用
本专利技术属于生物医学领域,涉及β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸的新的医用用途，具体涉及β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用。
技术介绍
现有技术公开了持续的血管生成能力是恶性肿瘤的重要特性，它为肿瘤细胞的生长提供氧和营养物质。多种抗血管生成的治疗方案已在恶性胶质瘤中得到检验，是治疗脑瘤最有前途的措施之一，但是，实践显示，目前的肿瘤血管抑制剂并不能够完全抑制肿瘤的生长，甚至能够反向刺激肿瘤复发后的血管生成，这就需要对肿瘤的血管生成及调节作进一步详细的研究了解。研究显示，脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,可造成神经系统的功能障碍，甚至威胁患者的生命，研究表明，无论原发性或继发性脑胶质瘤,其持续性生长都必须依赖于新血管的生成。在正常的成人中，除了创伤愈合及生殖周期外，几乎所有的新生血管形成都是病理性的。因此将血管作为靶点，抗肿瘤血管形成疗法成为有效的抗胶质瘤手段。细胞表面糖复合物中的糖链在肿瘤生长、粘附、迁移、侵袭和转移过程中起着重要的作用，目前多项研究表明，肿瘤细胞的恶性表型与细胞表面的糖链结构改变相关，在恶性肿瘤和转化细胞中N聚糖的外链分支Galβ1,4GlcNAcβ1,6Man链高表达，引起完全型N聚糖高度分支结构的形成，这是恶性转化细胞的一个重要特征。β1，4-半乳糖基转移酶参与细胞糖蛋白N-聚糖的修饰，从UDP-半乳糖上添加半乳糖基到GlcNAcβ1->6Man上，形成Galβ1->4GlcNAcβ1->6Man链。目前发现β1，4-半乳糖基转移酶共有七个家族成员在肿瘤的发生和个体发育中起重要的作用；β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ是1998年克隆的β1，4-半乳糖基转移酶家族的成员之一；CD31又称为血小板-内皮细胞粘附分子,分子量为130kDa,可以标记血管内皮细胞，其用来检测微血管密度，能定量反应胶质瘤血管生成情况，用于评估肿瘤血管生成。基于现有技术的研究现状，本申请的专利技术人拟提供β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸的新的医用用途，具体涉及β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的研究现状，提供β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸的新的医用用途，具体涉及β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用。本专利技术的抗胶质瘤血管发生的抑制剂，能为研发抗血管形成药物提供了新的靶点，对于胶质瘤的抗血管治疗具有重要提示意义。本专利技术进行了β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ对肿瘤血管生成的影响实验，选取了人的胶质母细胞瘤标本中分离出的胶质瘤起始细胞；研究显示，下调胶质瘤起始细胞中β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞的成瘤能力，抑制胶质瘤组织中的血管密度；下调胶质瘤起始细胞中β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞向血管内皮细胞的分化。进一步，所述的β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ的下调可以用于制备抗胶质瘤血管生成制剂，为抑制胶质瘤血管形成提供新的有效手段，以及可以作为肿瘤病人预后的一个指标。本专利技术提供了特异性抑制β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因表达的shRNA，用于抗胶质瘤血管研究，为实现上述目的，本专利技术将T698968细胞中的β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ用慢病毒载体介导稳定下调后发现血管形成能力下降，说明β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸可以抑制胶质瘤血管形成。更具体的，本专利技术提供了一种特异性抑制β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因表达的shRNA，所述的siRNA正义链与反义链如上文所示，载体为PLL3.7LACZ质粒。用于构建β1,4-半乳糖基转移酶Ⅴ(β1,4GalTⅤ)(human)shRNA的引物:β1,4GalTVshRNA1-F:5’-TGATGACGACCTCTGGAACATTCAAGAGATGTTCCAGAGGTCGTCATCTTTTTTC-3’β1,4GalTVshRNA1-R:5’-TCGAGAAAAAAGATGACGACCTCTGGAACATCTCTTGAATGTTCCAGAGGTCGTCATCA-3’；β1,4GalTVshRNA2-F:5’-TGACATCACATACGACGCCTTTTCAAGAGAAAGGCGTCGTATGTGATGTTTTTTTC-3’β1,4GalTVshRNA2-R:5’-TCGAGAAAAAAACATCACATACGACGCCTTTCTCTTGAAAAGGCGTCGTATGTGATGTCA-3’；β1,4GalTVshRNA3-F:5’-TCGGAGTGAGTGGCTTAACATTCAAGAGATGTTAAGCCACTCACTCCGTTTTTTC-3’β1,4GalTVshRNA3-R:5’-TCGAGAAAAAACGGAGTGAGTGGCTTAACATCTCTTGAATGTTAAGCCACTCACTCCGA-3’.。进一步，本专利技术的β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸可以用于制备靶向胶质瘤中β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ表达的试剂，或此外，作为胶质瘤病人的治疗辅助手段以及可以作为肿瘤病人预后的一个指标。本专利技术提供了包含编码所述shRNA的RNA干扰试剂盒，所述的试剂盒中包含所述的shRNA，应用时，该质粒载体在真核细胞中转录表达所需的siRNA，从而达到沉默β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因的表达。本专利技术还提供了所述shRNA在制备β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因表达抑制剂中的应用。本专利技术提供的shRNA能够特异性、高效地抑制β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因的mRNA和蛋白表达，从而达到抑制胶质瘤血管生成的作用。本专利技术为制备抗胶质瘤药物的提供一个新的靶点，并可以作为肿瘤病人预后的一个指标，具有良好的临床应用前景。附图说明图1为RT-PCR及westernblotting检测对照组(shLacz)和β1，4-半乳糖基转移酶V敲低组(shRNA)细胞中β1，4-半乳糖基转移酶mRNA及蛋白的表达量，RT-PCR中actin作为内参。图2为对照组和敲低组的细胞分别进行血管内皮细胞分化，显示β1，4-半乳糖基转移酶V干扰后形成的管腔结构减少(A-C,C为统计图)，并且发现β1，4-半乳糖基转移酶V干扰后形成的细胞表达血管内皮细胞标志物CD31减少(D-E,E为统计图)。图3显示了对照组和敲低组的细胞进行动物体内原位种植，发现β1，4-半乳糖基转移酶V干扰后形成的肿瘤较小、表面血管少(A-B)；裸鼠Kaplan-Meier生存分析图，裸鼠颅内分别被植入含有pLL3.7LacZshRNA对照质粒或β1，4GalTⅤshRNA干扰质粒的细胞，β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ稳定干扰后小鼠存活时间延长(C)。图4显示GFP标记的对照组和敲低组的细胞进行动物体内原位种植后，对其肿块进行免疫荧光分析，β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰后，来自肿瘤细胞的CD31血管内皮细胞减少(A-B,C图为统计图)。图5为利用REMBRANDT数据库进行Kaplan-Meier生存曲线分析结果图，证实β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ高表达的病人生存率低于β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ低表达的病人。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.β1，4‑半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ干扰核酸在制备抗胶质瘤血管生成制剂中的应用。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，下调胶质瘤起始细胞中β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞的成瘤能力，抑制胶质瘤组织中的血管密度；下调胶质瘤起始细胞中β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ，能抑制胶质瘤起始细胞向血管内皮细胞的分化。3.特异性抑制β1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ基因表达的shRNA在用于制备抑制胶质瘤血管形成制剂中的用途。4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的siRNA具有正义链与反义链，载体为PLL3.7LACZ质粒。5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，用于构建β1,4-半乳糖基转移酶Ⅴ(β1,4GalTⅤ)(human)shRNA的引物为:β1,4GalTVshRNA1-F:5’-TGATGACGACCTCTGGAACATTCAAGAGATGTTCCAGAGGTCGTCATCTTTTTTC-3’β1,4GalTVshRNA1-R:5’-TCGAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏湲颜，江建海，崔春红，师丹芳，邢洋，陈晓宁，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31